BD، 565877، BD Pharmingen™ Hoechst 34580

التفاعل: الإنسان، الفأر (تم اختباره أثناء التطوير)
التطبيقات: قياس التدفق الخلوي، الكيمياء المناعية الخلوية، التألق المناعي، التلوين داخل الخلايا (قياس التدفق الخلوي) (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869723
مادة التخزين: مسحوق مجفف بالتجميد
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية، مع حمايته من التعرض للضوء.
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: اترك صبغة BD Pharmingen™ Hoechst 34580 و1 مل من الماء المقطر حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 1 مل من الماء المقطر إلى قارورة الصبغة واخلط جيدًا للحصول على محلول بتركيز 1 ملغم/مل. افحص المحلول وكرر الخلط حتى تذوب الصبغة تمامًا. التخزين: عند الاستلام، خزّن الصبغة الجافة في مكان جاف بعيدًا عن الضوء عند درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد إذابتها بالماء، خزّن الصبغة المذابة في درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية في أجزاء صغيرة. تبقى الصبغة المذابة ثابتة لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينها وفقًا للتعليمات. الإجراء: التلوين المناعي الفلوري للخلايا الحية لتصوير النواة: 1. خفف محلول Hoechst 34580 إلى تركيز 1-5 ميكروغرام/مل في وسط كامل مباشرة قبل الاستخدام. ٢. أضف محلول هوكست ٣٤٥٨٠ إلى كل عينة، واحضنها عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية لمدة ٣٠-٦٠ دقيقة. يعتمد وقت التلوين المطلوب على نوع الخلية. ٣. اسحب الوسط الحاوي على هوكست ٣٤٥٨٠، وأضف محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) (رقم المنتج ٥٥٤٦٥٦) أو محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز ١×. يمكن أيضًا تحليل الخلايا دون غسل، ولكن قد يؤدي ذلك إلى زيادة التشويش الناتج عن الصبغة غير المرتبطة. ٤. تابع تحليل التألق المناعي. ٥. التلوين المناعي الفلوري للخلايا المثبتة لتصوير النواة: ١. ثبّت الخلايا واجعلها نفاذة حسب الرغبة. ٢. خفف محلول هوكست ٣٤٥٨٠ إلى تركيز ٠.٥-٢ ميكروغرام/مل في محلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز ١× مباشرةً قبل الاستخدام. ٣. أضف محلول هوكست ٣٤٥٨٠ إلى كل عينة قبل ١٥ دقيقة على الأقل من التحليل. ٤. تابع تحليل التألق المناعي دون غسل. ٥. تلوين الخلايا الحية لتحليل محتوى الحمض النووي بواسطة قياس التدفق الخلوي: ١. احصل على معلق خلوي أحادي. ٢. أعد تعليق الخلايا بتركيز ١ × ١٠^٦ خلية/مل في وسط كامل يحتوي على ١-١٠ ميكروغرام/مل من صبغة هوكست ٣٤٥٨٠. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة صبغة هوكست ٣٤٥٨٠ مباشرةً إلى المزرعة دون ترسيب إذا لم تتجاوز كثافة خلايا المزرعة ١ × ١٠^٦ خلية/مل. أ. في حالة التلوين بتركيز ١ × ١٠^٧ خلية/مل (على سبيل المثال، ١ × ١٠^٦ خلية في ١٠٠ ميكرولتر)، يكون تركيز التلوين الموصى به ٥-١٠ ميكروغرام/مل من صبغة هوكست ٣٤٥٨٠. ٣. حضّن عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية لمدة ١٥-٦٠ دقيقة. قد تختلف الكثافة الخلوية المثلى، وتركيز صبغة هوكست 34580، ومدة التلوين لتحليل محتوى الحمض النووي باختلاف نوع الخلية. ينبغي تحسين ظروف التحليل في التجارب الأولية للحصول على أفضل النتائج. 4. تُفصل الخلايا بالطرد المركزي ويُشفط الوسط الحاوي على صبغة هوكست 34580. أ. إذا كان سيتم إجراء تحليل الحمض النووي الريبوزي (مثل تسلسل الحمض النووي الريبوزي) بعد اكتمال تحليل محتوى الحمض النووي، تُغسل الخلايا 2-3 مرات في محلول منظم خالٍ من المصل (مثل محلول فوسفات ملحي 1×) لضمان الإزالة الكاملة لإنزيم RNase المتبقي في وسط زراعة الخلايا. 5. تُعلق الخلايا في محلول التلوين BD Pharmingen™ (مصل جنين البقر) أو محلول فوسفات ملحي 1×، ثم تُجرى عملية التحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي. أ. إذا كان سيتم فرز الخلايا، فإن إضافة صبغة هوكست 34580 مرة أخرى إلى محلول التحليل أثناء عملية الاكتساب بالتركيز المستخدم في التلوين قد يمنع تسرب الصبغة أثناء الفرز. ب. ينبغي تشغيل العينات بمعدل تدفق منخفض لتحقيق أفضل النتائج. قد تؤدي زيادة معدلات التدفق إلى ارتفاع معامل التباين (CV) لكل جزء من أجزاء دورة الخلية في مخطط توزيع الحمض النووي. ج. قد تكون برامج مثل ModFit LT™ (من شركة Verity Software House) أو FlowJo™ (من شركة FlowJo, LLC) مفيدة لتحليل مخططات توزيع محتوى الحمض النووي إلى أجزاء دورة الخلية. 6. تلوين الخلايا المثبتة لتحليل محتوى الحمض النووي باستخدام قياس التدفق الخلوي: 1. الحصول على معلق خلوي أحادي. 2. معالجة الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة باستخدام إيثانول بارد بنسبة 70-80%. 3. غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS). 4. تخفيف محلول Hoechst 34580 إلى تركيز 0.2-2 ميكروغرام/مل في محلول التلوين BD Pharmingen™ (FBS) أو محلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز 1× مباشرة قبل الاستخدام. ٥. تُصبغ الخلايا لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة بكثافة خلوية تتراوح بين ١ و ٢ × ١٠^٦ خلية/مل. لا حاجة للغسل قبل التحليل. أ. قد تختلف الكثافة الخلوية المثلى وتركيز صبغة هوكست ٣٤٥٨٠ لتحليل محتوى الحمض النووي باختلاف نوع الخلية. ينبغي تحسين ظروف التحليل في التجارب الأولية للحصول على أفضل النتائج. ٦. يُجرى التحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي. أ. ينبغي تشغيل العينات بمعدل تدفق منخفض لتحقيق أفضل النتائج. قد تؤدي زيادة معدلات التدفق إلى ارتفاع معامل التباين المئوي لكل جزء من أجزاء دورة الخلية في الرسم البياني لمحتوى الحمض النووي. ب. قد تكون برامج مثل ModFit LT™ (Verity Software House) أو FlowJo™ (FlowJo, LLC) مفيدة لفصل الرسوم البيانية لمحتوى الحمض النووي إلى أجزاء دورة الخلية. ٧. ملاحظة: يمكن استخدام كل من محلول BD Pharmingen™ Hoechst 34580 ومحلول BD Pharmingen™ Hoechst 33342 (رقم المنتج ٥٦١٩٠٨) بشكل متبادل في معظم التطبيقات وفقًا لإجراءات التحليل الموصى بها لكل صبغة. مع ذلك، في تحليل محتوى الحمض النووي، عادةً ما يُعطي Hoechst 34580 نتائج أفضل من Hoechst 33342 عند استخدام الليزر البنفسجي، بينما يُعطي Hoechst 33342 نتائج أفضل من Hoechst 34580 عند استخدام الليزر فوق البنفسجي.
ملاحظات حول المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى الرجوع إلى www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية.