BD، 565879، BD Pharmingen™ Indo-1 AM

التطبيق: قياس التدفق الخلوي (تم اختباره أثناء التطوير)
RRID: AB_2869725
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
إجراءات التحليل الموصى بها: التحضير: اترك مسحوق صبغة إندو-1 إيه إم وثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 10 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى مسحوق الصبغة ورج المحلول جيدًا. افحص المحلول وكرر الرج حتى تذوب الصبغة تمامًا. ينتج عن ذلك محلول مركز بتركيز 5 ملي مولار. التخزين: عند الاستلام، خزّن الصبغة الجافة في مكان جاف بعيدًا عن الضوء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. نوصي باستخدام قارورة صبغة جديدة لكل تجربة والتخلص من الصبغة المُعاد تكوينها بعد الاستخدام. مع ذلك، إذا كنت ستحتفظ بالمحاليل المركزة للاستخدام، فيجب تخزينها في مكان جاف بعيدًا عن الضوء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية واستخدامها في غضون أسبوع واحد من إعادة تكوينها. متطلبات قياس التدفق الخلوي: يمكن استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي المزودة بليزر فوق بنفسجي (355 نانومتر) (مثل BD LSRFortessa™ أو BD LSRFortessa™ X-20 أو BD™ LSR II). هذا الصبغ نسبي ويتطلب مجموعات مرشحات حول 400 نانومتر (مرتبط بالكالسيوم) و500 نانومتر (خالٍ من الكالسيوم). تعمل مجموعات المرشحات الخاصة بـ BUV395 (مثل 379/28) وBUV496 (مثل 515/30) مع مرآة ثنائية اللون عند 450 نانومتر بين مجموعات المرشحات بشكل جيد. تُحسب التغيرات النسبية في تركيز الكالسيوم عادةً كنسبة الانبعاث في مرشح الطول الموجي المنخفض إلى الانبعاث في مرشح الطول الموجي العالي. يُفضل تعويض التألق باستخدام عينة من الخلايا المراد فحصها مصبوغة بالصبغ. عند تصميم لوحات متعددة الألوان، يُرجى مراعاة تداخل الألوان في قناتي BD Horizon™ BV421 وBD Horizon BV510. يجب تحسين اللوحات لمراعاة هذا التداخل. إجراء وسم الخلايا باستخدام صبغة BD Pharmingen™ Indo-1 AM: 1. تحضير معلق خلوي أحادي بتركيز 1 × 10⁶ خلية/مل في محلول التحميل الفيزيولوجي المختار. أ. في حال استخدام المصل في محلول التحميل، يجب تعطيله بالحرارة لمنع نشاط إستراز المصل المتبقي من فصل جزيئات AM على الصبغة قبل دخولها إلى الخلايا. 2. إضافة محلول الصبغة المركز للحصول على تركيز نهائي للتلوين يتراوح بين 1 و10 ميكرومتر، ثم الخلط فورًا. أ. نوصي باستخدام أقل تركيز للصبغة يُعطي إشارة كافية لتجنب سمية الصبغة، والتجزئة الخلوية، وتوازن الكالسيوم. 3. التحضين لمدة 15-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أ. تشير التقارير إلى أن التجزئة الخلوية للصبغة تكون أقل أهمية عند درجات حرارة التحميل المنخفضة. في هذه الحالة، قد يكون من المفيد تحميل الخلايا في درجة حرارة الغرفة إذا كانت التجزئة الخلوية للصبغة مهمة لنوع الخلية محل الاهتمام. 4. غسل الخلايا مرة واحدة وإعادة تعليقها في محلول التحليل المختار. بالنسبة لبعض أنواع الخلايا، قد يكون من المفيد ترك الخلايا تتعافى لمدة 30-60 دقيقة إضافية لإتمام عملية إزالة مجموعة الإستر من جزيئات AM. في هذه الحالة، يجب حضانة الخلايا في محلول فسيولوجي مناسب أو وسط نمو كامل، ثم غسلها مرة أخرى، وإعادة تعليقها في محلول التحليل المناسب. 5. الانتقال إلى قياس التدفق الخلوي. أ. يمكن لمستخدمي جهاز BD FACSDiva™ إنشاء مُعامل نسبي قبل الحصول على البيانات من خلال علامة التبويب "النسبة" في قائمة جهاز قياس التدفق الخلوي. لا يمكن تعديل هذا المُعامل أثناء الحصول على البيانات. لذلك، قد يكون من المفيد إنشاء عينات تحكم (مثل عينة تحكم يتم تحفيزها باستخدام أيونوفور A23187 أو أيونوميسين) لضبط مقياس المُعامل النسبي مسبقًا لضمان أن تكون القيم النسبية ضمن النطاق. ب. بدلاً من ذلك، يمكن الحصول على البيانات لكل مُعامل غير نسبي على حدة، ثم حساب المُعامل النسبي من البيانات الأولية في برنامج FlowJo™ (FlowJo, LLC) كمُعامل مُشتق. ملاحظة: قبل التلوين بهذا الكاشف، يرجى التأكد من أن جهاز قياس التدفق الخلوي الخاص بك قادر على إثارة الفلوركروم وتمييز الفلورة الناتجة.
ملاحظات المنتج: نظرًا لاختلاف التطبيقات، ينبغي على كل باحث معايرة الكاشف للحصول على أفضل النتائج. يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى مراجعة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors.