BD، 567356، BD Pharmingen™ Alexa Fluor™ 647 Annexin V

التفاعل: بشري (اختبار مراقبة الجودة)
النمط المتماثل: لا شيء لا شيء
التطبيق: قياس التدفق الخلوي (يتم اختباره بشكل روتيني)
حجم العينة لكل اختبار: 5 ميكرولتر
معرف جين Entrez: 308
RRID: AB_3683800
محلول التخزين: محلول مائي منظم يحتوي على BSA و ≤0.09% أزيد الصوديوم.
الوضع التنظيمي: للاستخدام البحثي فقط
التحضير والتخزين: يُحفظ غير مخفف في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُحفظ بعيدًا عن الضوء لفترات طويلة. لا يُجمد. تم تنقية الجسم المضاد أحادي النسيلة من سائل مزرعة الأنسجة أو السائل الاستسقائي باستخدام كروماتوغرافيا التقارب. تم ربط الجسم المضاد بالصبغة في ظل الظروف المثلى، ثم أُزيلت الصبغة غير المتفاعلة.
إجراءات التحليل الموصى بها: يُعدّ Alexa Fluor™ 647 Annexin V مسبارًا حساسًا لتحديد الخلايا الميتة، حيث يرتبط بأسطح الفوسفوليبيدات سالبة الشحنة بألفة أعلى للفوسفاتيديل سيرين (PS) مقارنةً بمعظم الفوسفوليبيدات الأخرى. يعتمد ارتباط Alexa Fluor™ 647 Annexin V على الكالسيوم، لذا يلزم تحديد تركيزات معينة من الكالسيوم والأملاح للحصول على تلوين مثالي، كما هو موضح في بروتوكول تلوين Alexa Fluor™ 647 Annexin V. يجب على الباحثين ملاحظة أن تحليل التدفق الخلوي باستخدام Alexa Fluor™ 647 Annexin V على أنواع الخلايا الملتصقة (مثل HeLa وNIH-3T3 وغيرها) لا يُجرى بشكل روتيني، نظرًا لاحتمالية حدوث تلف محدد في الغشاء أثناء فصل الخلايا أو جمعها. مع ذلك، فقد نُشرت سابقًا طرق لاستخدام Annexin V في قياس التدفق الخلوي على أنواع الخلايا الملتصقة (Casiola-Rosen et al. وvan Engeland et al.). تحفيز موت الخلايا المبرمج بواسطة كامبتوثيسين: يُقدَّم البروتوكول التالي كمثال توضيحي لكيفية استخدام ألكسا فلور™ 647 أنيكسين V على خط خلوي (جركات). المواد: 1. تحضير محلول كامبتوثيسين المركز (سيجما-ألدريتش، رقم المنتج C-9911): 1 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. 2. خلايا جركات تي (ATCC TIB-152). الإجراء: 1. إضافة كامبتوثيسين (التركيز النهائي 4-6 ميكرومولار) إلى 1 × 10^6 خلية جركات. 2. حضانة الخلايا لمدة 4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية. 3. اتباع بروتوكول تلوين ألكسا فلور™ 647 أنيكسين V لقياس موت الخلايا المبرمج. الكواشف: 1. ألكسا فلور™ 647 أنيكسين V: مُضمَّن. استخدم 5 ميكرولتر لكل اختبار. ٢. ٧-أمينو-أكتينوميسين د (٧-AAD): غير مُضمّن. ٧-AAD (رقم المنتج ٥٥٩٩٢٥) صبغة حمض نووي سهلة الاستخدام وجاهزة للاستخدام، ذات تألق قابل للكشف في نطاق الأشعة تحت الحمراء البعيدة من الطيف. استخدم ٥ ميكرولتر لكل اختبار. ٣. محلول ربط أنيكسين بتركيز ١٠ أضعاف: غير مُضمّن. ٠.١ مولار هيبس (الأس الهيدروجيني ٧.٤)، ١.٤ مولار كلوريد الصوديوم، ٢٥ ملي مولار كلوريد الكالسيوم. يُحفظ في درجة حرارة ٤ درجات مئوية. بدلاً من ذلك، يمكن شراء محلول ربط أنيكسين V من BD Pharmingen™، بتركيز ١٠ أضعاف (رقم المنتج ٥٥٦٤٥٤). بروتوكول تلوين أنيكسين V باستخدام Alexa Fluor™ ٦٤٧: التلوين ١. اغسل الخلايا مرتين بمحلول فوسفات بارد، ثم أعد تعليقها في محلول الربط بتركيز ١× بتركيز ١ × ١٠^٦ خلية/مل. ٢. انقل ١٠٠ ميكرولتر من معلق الخلايا (١ × ١٠^٥ خلية) إلى أنبوب زراعة سعة ٥ مل. ٣. أضف ٥ ميكرولتر من Alexa Fluor™ 647 Annexin V (للتحليل أحادي اللون وثنائي اللون) و٥ ميكرولتر من 7-AAD (للتحليل ثنائي اللون فقط). ٤. رجّ الخلايا برفق باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حضّنها لمدة ١٥ دقيقة في درجة حرارة الغرفة (٢٥ درجة مئوية) في الظلام. ٥. أضف ٤٠٠ ميكرولتر من محلول ربط Annexin V بتركيز ١× إلى كل أنبوب. حلل باستخدام قياس التدفق الخلوي خلال ساعة واحدة. الضوابط المقترحة لإعداد قياس التدفق الخلوي: تُستخدم الضوابط التالية لضبط التعويض والأرباع: ١. خلايا غير مصبوغة. ٢. خلايا مصبوغة بـ Alexa Fluor™ 647 Annexin V فقط (بدون 7-AAD). 3. الخلايا المصبوغة بـ 7-AAD فقط (بدون Alexa Fluor™ 647 Annexin V). ضوابط التلوين الأخرى: يجب استخدام سلالة خلوية يسهل تحفيزها على الخضوع للاستماتة للحصول على تلوين تحكم إيجابي باستخدام Alexa Fluor™ 647 Annexin V فقط أو باستخدام Alexa Fluor™ 647 Annexin V و7-AAD. من المهم ملاحظة أن المستوى الأساسي للاستماتة والنخر يختلف اختلافًا كبيرًا داخل المجموعة الخلوية. وبالتالي، حتى في غياب الاستماتة المحفزة، ستحتوي معظم مجموعات الخلايا على نسبة ضئيلة من الخلايا التي تُظهر استماتة (Alexa Fluor™ 647 Annexin V إيجابي، 7-AAD سلبي أو Alexa Fluor™ 647 Annexin V إيجابي، 7-AAD إيجابي). تُستخدم المجموعة غير المعالجة لتحديد المستوى الأساسي للخلايا الميتة والمستميتة. تُحدد نسبة الخلايا التي حُثّت على الخضوع للاستماتة عن طريق طرح نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة غير المعالجة من نسبة الخلايا المستميتة في المجموعة المعالجة. وبما أن موت الخلايا هو النتيجة النهائية للاستماتة، فإن الخلايا في المراحل المتأخرة من الاستماتة ستكون ذات غشاء تالف وستُظهر تفاعلًا إيجابيًا مع كلٍ من 7-AAD وAlexa Fluor™ 647 Annexin V. وبالتالي، لا يُميّز هذا الاختبار بين الخلايا التي خضعت بالفعل للاستماتة وتلك التي ماتت نتيجةً لمسار النخر، لأن الخلايا الميتة في كلتا الحالتين ستُظهر تفاعلًا إيجابيًا مع كلٍ من Alexa Fluor™ 647 Annexin V و7-AAD.
إشعارات المنتج: يُرجى مراجعة www.bdbiosciences.com/us/s/resources للاطلاع على البروتوكولات الفنية. يتم جمع انبعاث الفلوركروم Alexa Fluor® 647 بنفس إعدادات الجهاز المستخدمة مع الألوفيوكوسيانين (APC). تحذير: ينتج أزيد الصوديوم حمض الهيدرازويك شديد السمية في الظروف الحمضية. خفف مركبات الأزيد بالماء الجاري قبل التخلص منها لتجنب تراكم رواسب قابلة للانفجار في أنابيب الصرف الصحي. تم تخفيف هذا الكاشف مسبقًا للاستخدام بالحجم الموصى به لكل اختبار. نستخدم عادةً 1 × 10^6 خلية في عينة تجريبية بحجم 100 ميكرولتر (اختبار). للاطلاع على أطياف الفلوركروم وإعدادات الجهاز المناسبة، يُرجى مراجعة صفحة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان على موقعنا الإلكتروني www.bdbiosciences.com/colors. مصدر جميع بروتينات المصل هو مسالخ معتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية تقع في الولايات المتحدة. يُقدَّم هذا المنتج بموجب ترخيص ملكية فكرية بين شركة لايف تكنولوجيز كوربوريشن وشركة بي دي بيزنسز. يمنح شراء هذا المنتج المشتري حقًا غير قابل للتحويل لاستخدام الكمية المشتراة من المنتج ومكوناته في الأبحاث التي يجريها المشتري (سواء كان المشتري جهة أكاديمية أو ربحية). لا يجوز للمشتري بيع أو نقل (أ) هذا المنتج، أو (ب) مكوناته، أو (ج) المواد المصنعة باستخدام هذا المنتج أو مكوناته إلى طرف ثالث، أو استخدام هذا المنتج أو مكوناته أو المواد المصنعة باستخدام هذا المنتج أو مكوناته لأغراض تجارية. تشمل الأغراض التجارية أي نشاط يقوم به أي طرف مقابل عوض، وقد تشمل، على سبيل المثال لا الحصر: (1) استخدام المنتج أو مكوناته في التصنيع؛ (2) استخدام المنتج أو مكوناته لتقديم خدمة أو معلومات أو بيانات؛ (3) استخدام المنتج أو مكوناته لأغراض علاجية أو تشخيصية أو وقائية؛ أو (4) إعادة بيع المنتج أو مكوناته، سواءً أُعيد بيعها لاستخدامها في الأبحاث أم لا. للحصول على معلومات حول شراء ترخيص لهذا المنتج لأي استخدام آخر، يُرجى التواصل مع شركة لايف تكنولوجيز، وحدة أعمال تحليل الخلايا، قسم تطوير الأعمال، 29851 طريق ويلو كريك، يوجين، أوريغون 97402، الولايات المتحدة الأمريكية، هاتف: 5414658300، فاكس: 5413350504. يُرجى زيارة الموقع الإلكتروني http://regdocs.bd.com للاطلاع على صحائف بيانات السلامة (SDS). أليكسا فلور™ علامة تجارية مسجلة لشركة لايف تكنولوجيز. للاطلاع على براءات الاختراع الأمريكية التي قد تنطبق، يُرجى زيارة الموقع الإلكتروني bd.com/patents.