CST، 13653S، SimpleChIP® بادئات محفز بيتا أكتين البشري

مجموعة تمهيدية لدراسة بيتا-أكتين في مجال البحث. معلومات استخدام المنتج ١. ضع علامة على العدد المناسب من أنابيب أو صفائح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتوافقة مع طراز جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-time PCR) المستخدم. يجب إجراء تفاعلات PCR مرتين، ويجب أن تتضمن أنبوبًا خاليًا من الحمض النووي للتحكم في التلوث، وتخفيفًا متسلسلًا لـ ٢٪ من إجمالي الحمض النووي للكروماتين المدخل (غير مخفف، ١:٥، ١:٢٥، ١:١٢٥)، والذي يُستخدم لإنشاء منحنى معياري وتحديد كفاءة التضخيم. ٢. أضف ٢ ميكرولتر من عينة الحمض النووي ChIP المناسبة إلى كل أنبوب أو بئر في صفيحة PCR. ٣. حضّر مزيج تفاعل PCR الرئيسي كما هو موضح أدناه. أضف كمية كافية من الكواشف لتفاعلين إضافيين لتعويض فقدان الحجم. أضف ١٨ ميكرولتر من مزيج تفاعل PCR الرئيسي إلى كل أنبوب أو بئر في صفيحة PCR. حجم الكواشف لتفاعل PCR واحد (20 ميكرولتر): ماء خالٍ من النيوكلياز 6 ميكرولتر، بادئات SimpleChIP® بتركيز 5 ميكرومولار 2 ميكرولتر، مزيج تفاعل SYBR® Green بتركيز 2X 10 ميكرولتر. 4. ابدأ برنامج تفاعل PCR التالي: أ. التفكك الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ب. التفكك: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. ج. التلدين والاستطالة: درجة حرارة خاصة بكل بادئ لمدة 60 ثانية. د. كرر الخطوتين ب وج لمدة 40 دورة. 5. حلل نتائج تفاعل PCR الكمي باستخدام البرنامج المرفق بجهاز PCR في الوقت الحقيقي. تخزين يُقدّم المنتج في ماء خالٍ من النيوكلياز بتركيز 5 ميكرومولار (يبلغ التركيز النهائي لكل بادئ 5 ميكرومولار). يُحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. بروتوكول البروتوكولات المتاحة: ترسيب الكروماتين المناعي النوعية / الحساسية التفاعل مع الأنواع: الإنسان خلفية يُعدّ اختبار الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) تقنيةً فعّالةً ومتعددة الاستخدامات لدراسة تفاعلات البروتين مع الحمض النووي (DNA) ضمن سياق الكروماتين الطبيعي للخلية (1، 2). يُمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد العديد من البروتينات المرتبطة بمنطقة مُحددة من الجينوم، أو على العكس، لتحديد العديد من مناطق الجينوم التي يرتبط بها بروتين مُعين (3-6). كما يُمكن استخدامه لتحديد الترتيب المُحدد لاستقطاب البروتينات المختلفة إلى مُحفز الجين، أو لقياس الكمية النسبية لتعديل هيستون مُعين عبر موقع جيني كامل (3، 4). بالإضافة إلى بروتينات الهيستون، يُمكن استخدام اختبار ChIP لتحليل ارتباط عوامل النسخ والعوامل المُساعدة، وعوامل تضاعف الحمض النووي، وبروتينات إصلاح الحمض النووي. عند إجراء اختبار ChIP، تُثبّت الخلايا أو الأنسجة أولاً بالفورمالديهايد، وهو عامل ربط مُتبادل قابل للعكس بين البروتين والحمض النووي، والذي يحافظ على تفاعلات البروتين مع الحمض النووي التي تحدث في الخلية (1، 2). تُحلل الخلايا ويُستخلص الكروماتين ويُجزأ باستخدام الموجات فوق الصوتية أو الهضم الأنزيمي. ثم يُخضع الكروماتين لعملية ترسيب مناعي باستخدام أجسام مضادة نوعية لبروتين معين أو تعديل هيستوني محدد. أي تسلسلات DNA مرتبطة بالبروتين أو التعديل الهيستوني محل الاهتمام ستترسب مع الكروماتين كجزء من المركب الكروماتيني المتشابك، وستزداد الكمية النسبية لهذا التسلسل DNA من خلال عملية الانتقاء المناعي. بعد الترسيب المناعي، تُفك روابط البروتين-DNA المتشابكة ويُنقى الحمض النووي. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (PCR) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) لقياس مقدار زيادة تسلسل DNA معين بواسطة الترسيب المناعي النوعي للبروتين (1، 2). بدلاً من ذلك، يمكن دمج فحص ChIP مع تقنيات المصفوفات الدقيقة لتقسيم الجينوم (ChIP على رقاقة)، ​​أو التسلسل عالي الإنتاجية، أو استراتيجيات الاستنساخ، وكلها تسمح بتحليل شامل للجينوم لتفاعلات البروتين-DNA وتعديلات الهيستون (5-8). أسماء بديلة ChIP؛ ترسيب الكروماتين المناعي؛ تفاعل البوليميراز المتسلسل؛ البادئ؛ البادئات؛ SimpleChIP مواصفة التفاعل: H