CST، 52749S، طقم PNGase F

مجموعة أدوات أساسية للدراسة في مجال البحث. معلومات استخدام المنتج شروط تفاعل التمسخ: 1. أضف 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول تمسخ البروتين السكري (10x)، والماء (إذا لزم الأمر) ليصل الحجم الكلي إلى 10 ميكرولتر. 2. سخّن التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتمسخ البروتين السكري. 3. برّد التفاعل على الجليد ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 ثوانٍ. 4. أضف 2 ميكرولتر من محلول غليكوبافر II (10x)، و2 ميكرولتر من NP-40 بتركيز 10%، و6 ميكرولتر من الماء ليصل الحجم الكلي للتفاعل إلى 20 ميكرولتر. ملاحظة: يُثبّط SDS إنزيم PNGase F، لذا من الضروري وجود NP-40 في مزيج التفاعل في ظروف التمسخ. عدم تضمين NP-40 في بروتوكول التمسخ سيؤدي إلى فقدان النشاط الإنزيمي. ٥. أضف ١ ميكرولتر من PNGase F، واخلط برفق. ٦. حضّن عند ٣٧ درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ٧. حلل بالطريقة التي تختارها. ملاحظة: أبسط طريقة لتقييم مدى إزالة الغليكوزيل هي عن طريق تغيرات الحركة على هلام SDS-PAGE. ملاحظة: يجب تحديد أوقات التحضين المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة على حدة. ظروف التفاعل غير المتمسخ: عند إزالة الغليكوزيل من بروتين سكري طبيعي، يُوصى بتعريض جزء من البروتين السكري لبروتوكول التمسخ لتوفير عنصر تحكم إيجابي للبروتين منزوع الغليكوزيل بالكامل. يمكن بعد ذلك مقارنة التفاعل غير المتمسخ بالتفاعل المتمسخ لتحديد مدى اكتمال التفاعل. ١. أضف ١-٢٠ ميكروغرام من البروتين السكري، و٢ ميكرولتر من محلول إزالة طبيعة البروتين السكري (١٠x)، والماء (إذا لزم الأمر) ليصل الحجم الكلي إلى ٢٠ ميكرولتر. ٢. أضف ٢-٥ ميكرولتر من إنزيم PNGase F، واخلط برفق. ٣. حضّن المزيج عند درجة حرارة ٣٧ درجة مئوية لمدة ٤-٢٤ ساعة. ملاحظة: لإزالة الغليكوزيل من البروتين السكري الأصلي، قد يلزم وقت حضانة أطول وكمية أكبر من الإنزيم. ٤. حلل باستخدام الطريقة التي تختارها. ملاحظة: أبسط طريقة لتقييم مدى إزالة الغليكوزيل هي قياس تغيرات الحركة على هلام SDS-PAGE. تخزين جميع مكونات هذه المجموعة مستقرة لمدة 24 شهرًا عند تخزينها في درجة الحرارة الموصى بها. قسّمها إلى حصص صغيرة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. النوعية / الحساسية تزيل مجموعة PNGase F بشكل فعال المانوز العالي المصدر / التنقية يتم إنتاج مكون PNGase F في سلالة من البكتيريا وهو خالٍ من البروتيازات ونشاط Endo F.