CST، 9806S، مخزن مؤقت RIPA (10X)

مساحة احتياطية للدراسة في مجال البحث. معلومات استخدام المنتج قد تظهر تكتلات في هذا المحلول المنظم عند وصوله نظرًا لتركيزات الكواشف العالية في تركيبة 10X المرفقة. في بعض الأحيان، تستمر هذه التكتلات حتى بعد تسخين المحلول إلى درجة حرارة الغرفة. نوصي بتسخين المحلول المنظم إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع التقليب لإزالة الرواسب. بدلاً من ذلك، يمكن تخفيف محلول RIPA 10X بالماء المقطر (ddH2O) إلى 5X على الأقل للحصول على محلول خالٍ من الرواسب. بعد التخفيف، يمكن تقسيم المحلول إلى حصص صغيرة وتخزينه عند -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقًا. 1. قم بإذابة المحلول المنظم 10X عند درجة حرارة 24-30 درجة مئوية مع التقليب المستمر. 2. خفف محلول RIPA المنظم 10X إلى محلول 1X باستخدام الماء المقطر (ddH2O). يوفر هذا المنتج كمية كافية من المادة 10X لتحضير 150 مل من مستخلص الخلية الكاملة. 3. ضع المحلول المنظم 1X في الثلاجة على الجليد وأضف 1 ملي مول من PMSF قبل الاستخدام مباشرة. التحلل: يجب حفظ جميع الكواشف والمستخلصات باردة. 1. عالج الخلايا حسب الرغبة. 2. اغسل الطبق بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) لإزالة الوسط المتبقي. 3. أضف محلول RIPA بتركيز 1X إلى الخلايا: (أ) للخلايا الملتصقة، أضف 400 ميكرولتر من محلول RIPA بتركيز 1X لكل طبق 10 سم. (ب) للخلايا غير الملتصقة، أضف 400 ميكرولتر من المحلول لكل 10⁷ خلية بعد غسلها بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز 1X وترسيبها. 4. حضّن الطبق على الجليد لمدة 5 دقائق. ٥. اكشط الخلايا. ٦. عالجها بالموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة. ٧. افصل المستخلص بالطرد المركزي لمدة ٥ دقائق عند ١٤٠٠٠ ضعف قوة الجاذبية الأرضية في جهاز طرد مركزي بارد. ٨. تخلص من السائل الطافي لاستخدامه. يمكن استخدام محلول RIPA بتركيز ١X لتحليل عينات الأنسجة، مع التوصية بإجراء عملية تجانس بعد إضافة محلول التحليل. استخلص النسيج بنسبة ١٠٠ ملغ من النسيج إلى ١ مل من المحلول. يلزم أيضًا معالجة مستخلص النسيج بالموجات فوق الصوتية. يمكن إضافة مثبطات البروتياز الإضافية إلى محلول التحليل بتركيز ١X بسهولة. تخزين محلول RIPA بتركيز 1X: 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.5)، 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار Na2EDTA، 1 ملي مولار EGTA، 1% NP-40، 1% ديوكسيكولات الصوديوم، 2.5 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم، 1 ملي مولار بيتا-جليسروفوسفات، 1 ملي مولار Na3VO4، 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين. للتخزين طويل الأمد، يُحفظ محلول RIPA بتركيز 10X عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. في حال الاستخدام المتواصل للمحلول، يُنصح بحفظه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوع إلى أسبوعين. يُنصح بتقسيم محلول RIPA بتركيز 10X إلى حصص صغيرة عند إجراء العديد من التجارب الصغيرة. كما يمكن تقسيم محلول RIPA بتركيز 1X إلى حصص للاستخدام الفردي وتخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.