نيو إنجلاند بيولابس، C2523H، NEBExpress® بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة (عالية الكفاءة)

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة: التعبير غير T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، التطبيقات ، التعبير غير T7، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات التعبير عن البروتين ، المضاد الحيوي لاختيار البلازميد، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة: س: هل تقدم شركة نيو إنجلاند بيولابس سلالات من الإشريكية القولونية المؤهلة والمناسبة للتعبير عن البروتين؟ ج: نعم، لدينا العديد من السلالات للتعبير عن البروتين. يُقدَّم السلالة BL21(DE3) (NEB #C2527) للتعبير الروتيني باستخدام T7، بينما تُقدَّم السلالة BL21 (NEB #C2530) للتعبير غير المعتمد على T7. أما السلالة NEBExpress (NEB #C2523) فهي مشتق مُحسَّن من BL21، بينما تُتيح السلالة NEB Express Iq (NEB #C3037) تحكمًا دقيقًا في التعبير من نواقل تحتوي على مُحفِّزات lac أو tac أو trc أو T5-lac0. وتُعدّ سلالتا T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) وT7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) مشتقات مُحسَّنة من BL21(DE3). تُتيح سلالة lacIq تحكمًا أدق في التعبير. وتتوفر كلتا السلالتين مع خاصية lysY لتحكم استثنائي في التعبير (T7 Express lysY، NEB #C3010 وT7 Express lysY/Iq، NEB #C3013). تُقدّم شركة NEB أيضًا سلالات SHuffle™ القادرة على طي البروتينات بشكل صحيح، حتى تلك التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد متعددة في السيتوبلازم. يُمكن استخدام SHuffle™ Express (NEB #C3028H) مع مُحفّزات غير T7، أو SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) مع نواقل التعبير عن مُحفّز T7. أما للتعبير عن مُحفّز T7 السام، فإن SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) هو الخيار الأمثل. تُقدّم هذه السلالات الثلاث أيضًا كسلالات K12: SHuffle™ (NEB #C3025H)، وSHuffle™ T7 (NEB #C3026H)، وSHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). يتوفر Lemo21(DE3) (NEB #C2528) للتعبير القابل للضبط عن أهداف صعبة، مثل البروتينات الغشائية، والبروتينات السامة، والبروتينات المعرضة للتعبير غير الذائب. تم تصميم NiCo21(DE3) (NEB #C2529) للتعبير الروتيني عن البروتينات الموسومة بالهيستيدين وتنقيها. س: ما هي المدة اللازمة لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2523H وNEB #C2523I)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع خلايا NEB Express المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. عند اختبارها مع pUC19، لم تؤثر مدة الحضانة البالغة 20 دقيقة سلبًا على كفاءة التحويل (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2523)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون) 0.5% مستخلص خميرة 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز LB أجار: 1% تريبتون 0.5% مستخلص خميرة 0.17 مولار كلوريد الصوديوم 1.5% أجار س: ما هي خصائص السلالة (C2523)؟ ج: الخصائص التي تساهم في فائدة هذه السلالة كسلالة للتعبير عن البروتين موصوفة أدناه. الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص تظهر بين قوسين. نقص البروتياز ([lon] ompT): سلالات الإشريكية القولونية B تعاني من نقص طبيعي في بروتياز lon الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد إنزيم OmpT البروتيني على سطح بكتيريا الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالتي K-12 وB، ويُفترض أنه يُساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. وتكون الخلايا التي تفتقر إلى كلا هذين الإنزيمين البروتينيين أكثر استجابةً لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. التعافي من تلف الحمض النووي (sulA11): تستطيع خلايا الإشريكية القولونية تحمل قدر كبير من تلف الحمض النووي المزمن طالما سُمح لعملية الإصلاح بالاستمرار. وتتأثر هذه القدرة سلبًا إذا لم تتمكن الخلايا من الانقسام بعد الإصلاح. في خلايا lon-، يتراكم بروتين SulA، وهو مثبط لانقسام الخلايا، مما يجعل الخلايا شديدة الحساسية لتلف الحمض النووي. تسمح طفرة sulA للخلايا بالانقسام بشكل طبيعي في غياب إنزيم Lon البروتيني. نقص الإندونوكلياز I: (endA) يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، مما يُحسّن جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10) تحمل سلالات الإشريكية القولونية B من النوع البري إندونوكلياز تقييد من النوع الأول، والذي يقطع الحمض النووي عند الموقع TGA(N8)TGCT. بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل مُماثل، فإن الحمض النووي الغريب سيُقطع عند هذه المواقع. يؤدي الحذف المذكور أعلاه إلى إزالة كل من ناقل الميثيل والإندونوكلياز. نقص تقييد الميثيل: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10 و R(mcr-73::miniTn10--TetS)2): تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات المشفرة بواسطة mcrA و mcrBC و mrr، والتي تقوم بقطع الحمض النووي ذي أنماط الميثيل الموجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. تم تعطيل جميع إنزيمات Mcr الثلاثة و Mrr في T7 Express، مما يسمح بإدخال الحمض النووي حقيقي النواة ذي الأصل الجينومي (مثل المكتبات الأولية) عند الرغبة. مقاومة العاثية T1: (fhuA2) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: ما الفرق بين NEB #C2523H وNEB #C2523I؟ ج: هما نفس الخلايا بنفس الكفاءة، لكنهما متوفران بأشكال مختلفة. تأتي C2523H في عبوة تحتوي على 20 أنبوب تحويل للاستخدام لمرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. أما C2523I فتأتي في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على خلايا كافية لأربع عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. إذا كنت تجري 3 أو 4 عمليات تحويل في المرة الواحدة، فإن استخدام C2523I يُعدّ خيارًا اقتصاديًا. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها، لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا ينمو أي بروتين في المزرعة السائلة (C2523)؟ ج: قد يكون هناك تعبير أساسي في مضيف NEBExpress. إذا كان من المحتمل أن يكون البروتين المُعبَّر عنه سامًا، فيجب إجراء تحويل بلازميد التعبير في: » NEB Express Iq (NEB# C3037): يؤدي الإفراط في التعبير عن مثبط LacI إلى تقليل التعبير الأساسي. قد يؤدي الحضانة عند 30 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة أيضًا إلى تخفيف مشاكل السمية. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من تركيز المضاد الحيوي (اختبره باستخدام بلازميد تحكم). س: لماذا يكون البروتين المُحفَّز غير قابل للذوبان (C2523)؟ ج: تحقق من عدم الذوبان - هذا مهم لأن التعبير العالي وإنتاج البروتين بكميات كبيرة يمكن أن يؤدي إلى أن يصبح البروتين المستهدف غير قابل للذوبان. الحلول المحتملة لهذه المشكلة هي: » التحفيز في درجات حرارة منخفضة (حتى 15 درجة مئوية طوال الليل) » تقليل تركيز IPTG إلى ما بين 0.01 و0.1 ملي مولار » التحفيز لفترة أقصر (حتى 15 دقيقة) » التحفيز في وقت مبكر من النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4) س: لماذا لا يظهر أي بروتين على الهلام أو لا يوجد نشاط (C2523)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا قد تخلصت من عناصر في بلازميد التعبير أو حذفتها. » قم بزراعة الخلايا لتحفيز إنتاج البروتين. قبل التحفيز مباشرة، قم بزراعة عينة على طبقين متطابقين مع وبدون اختيار المضاد الحيوي. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق كبير في عدد المستعمرات على الأطباق. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق التي تحتوي على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنة بالأطباق التي لا تحتوي على المضاد الحيوي. » إذا كانت السمية هي المشكلة، اختبر المضيف Iq المذكور أعلاه لتقليل مستوى التعبير الأساسي. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وفقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع واحد من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: هل يمكن استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEBExpress (عالية الكفاءة) للتعبير عن التركيبات التي تحتوي على محفز T7؟ ج: لا. لا تدعم بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEBExpress التعبير عن التركيبات التي تحتوي على محفز T7. للتعبير عن هذه التركيبات، نوصي باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية T7 Express Competent E.coli (عالية الكفاءة) (NEB #C2566). س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2523H وNEB #C2523I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 20 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية NEBExpress (NEB #C2523H وNEB #C2523I). توقع انخفاضًا بنسبة 50% تقريبًا في كفاءة التحويل عند التعرض للصدمة الحرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB ذات الاستخدام الواحد، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (بدلاً من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (بدلاً من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (بدلاً من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2523H وNEB #C2323I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية سنتان من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "الخلط والتشغيل"؟ ج: يوجد بروتوكول "الخلط والتشغيل" الذي يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت شركة NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقارنةً بمنتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ إلا أن مستعمرات NEB أكبر حجمًا عند استخدام نفس فترة الحضانة. س: كيف يُخزَّن وسط نمو SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع خلاياي المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه في درجة حرارة الغرفة فقط، وإلا ستتكون بلورات.