نيو إنجلاند بيولابس، C2527I، BL21(DE3) بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة: التعبير عن T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، تطبيقات التعبير عن T7، ربط الببتيد، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات المضاد الحيوي لاختيار البلازميد ، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة: س: هل توفر شركة نيو إنجلاند بيولابس سلالات من الإشريكية القولونية المؤهلة والمناسبة للتعبير عن البروتين؟ ج: نعم، لدينا العديد من السلالات للتعبير عن البروتين. يُقدَّم السلالة BL21(DE3) (NEB #C2527) للتعبير الروتيني باستخدام T7، بينما تُقدَّم السلالة BL21 (NEB #C2530) للتعبير غير المعتمد على T7. أما السلالة NEBExpress (NEB #C2523) فهي مشتق مُحسَّن من BL21، بينما تُتيح السلالة NEB Express Iq (NEB #C3037) تحكمًا دقيقًا في التعبير من نواقل تحتوي على مُحفِّزات lac أو tac أو trc أو T5-lac0. وتُعدّ سلالتا T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) وT7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) مشتقات مُحسَّنة من BL21(DE3). تُتيح سلالة lacIq تحكمًا أدق في التعبير. وتتوفر كلتا السلالتين مع خاصية lysY لتحكم استثنائي في التعبير (T7 Express lysY، NEB #C3010 وT7 Express lysY/Iq، NEB #C3013). تُقدّم شركة NEB أيضًا سلالات SHuffle™ القادرة على طي البروتينات بشكل صحيح، حتى تلك التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد متعددة في السيتوبلازم. يُمكن استخدام SHuffle™ Express (NEB #C3028H) مع مُحفّزات غير T7، أو SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) مع نواقل التعبير عن مُحفّز T7. أما للتعبير عن مُحفّز T7 السام، فإن SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) هو الخيار الأمثل. تُقدّم هذه السلالات الثلاث أيضًا كسلالات K12: SHuffle™ (NEB #C3025H)، وSHuffle™ T7 (NEB #C3026H)، وSHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). يتوفر Lemo21(DE3) (NEB #C2528) للتعبير القابل للضبط عن أهداف صعبة، مثل البروتينات الغشائية، والبروتينات السامة، والبروتينات المعرضة للتعبير غير الذائب. صُممت سلالة NiCo21(DE3) (NEB #C2529) للتعبير الروتيني عن البروتينات الموسومة بالهيستيدين وتنقيها. س: ما هي خصائص السلالة (C2527)؟ ج: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتينات. تظهر الأنماط الجينية المسؤولة عن هذه الخصائص بين قوسين. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7: يُشفّر الجين (T7 gene1) بواسطة طليعة العاثية لامدا DE3 الموجودة داخل الكروموسوم. يُعبّر عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 من مُحفّز lacUV5، وهو أقل حساسية لتثبيط الكاتابوليت من مُحفّز lac الأصلي. وبالتالي، قد تُظهر سلالات DE3 تعبيرًا غير مُحفّز عن البروتين المستهدف. على الرغم من أن λDE3 يكون عادةً خاملاً في كروموسوم العائل، إلا أن تحفيز سلسلة SOS قد يحدث نتيجةً للتعبير عن بروتينات تُلحق الضرر بكروموسوم الإشريكية القولونية، سواءً بشكل مباشر أو غير مباشر. قد يؤدي ذلك إلى تحلل الخلية. لا تحمل سلالات T7 Express طليعة العاثية DE3، وتتحمل استجابة SOS بشكل أفضل. تفتقر سلالات الإشريكية القولونية B إلى إنزيم البروتياز lon بشكل طبيعي، وهو إنزيم يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد إنزيم OmpT على سطح الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالات K-12 وB، ويُفترض أنه يساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. تكون الخلايا التي تفتقر إلى كلا هذين الإنزيمين أكثر استجابة لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. مقاومة العاثية T1 (fhuA2): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا ينمو أي شيء في المزرعة السائلة (C2527)؟ ج: لا يخضع التعبير عن T7 في سلالة BL21(DE3) لتنظيم دقيق، وبالتالي قد تؤثر البروتينات السامة على حيوية الخلايا، خاصةً إذا لم يكن ناقل التعبير يحمل جين lacI. وللحصول على تعبير منظم بدقة، استخدم سلالة تُعبر عن lysY: T7 Express lysY (NEB #C3010): يُنتج lysY إنزيم الليزوزيم T7 الطافر الذي يرتبط بإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، مما يقلل من التعبير الأساسي للبروتين المستهدف. عند التحفيز، يُزيل إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 المُصنّع حديثًا الليزوزيم، مما يؤدي إلى التعبير عن البروتين المستهدف. T7 Express lysY/Iq (NEB #C3013): يُعبر عن lysY بالإضافة إلى الإفراط في التعبير عن lacI لكبح التعبير الأساسي لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. Lemo21(DE3) (NEB #C2528): سلالة BL21(DE3) تحتوي على نظام Lemo™. يتم تنظيم التعبير عن lysY بواسطة L-رامنوز، مما يجعل التعبير عن بروتين T7 منظمًا بدقة وقابلًا للتعديل. س: لماذا يكون البروتين المُحفز غير قابل للذوبان (C2527)؟ ج: تحقق من عدم الذوبان - هذا مهم لأن التعبير عن T7 غالبًا ما يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة جدًا من البروتين، مما قد يؤدي إلى عدم ذوبان البروتين المستهدف. الحلول المتاحة هي: التحفيز عند درجة حرارة منخفضة (حتى 15 درجة مئوية طوال الليل)، تقليل تركيز IPTG إلى 40 ميكرومولار، التحفيز في وقت مبكر من مرحلة النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4)، اختبار التعبير في Lemo21(DE3). س: لماذا لا يظهر أي بروتين على الهلام أو لا يوجد نشاط (C2527)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا قد حذفت أو أزالت عناصر من بلازميد التعبير. قم بزراعة الخلايا لتحفيز إنتاج البروتين. قبل بدء عملية التحفيز مباشرةً، ازرع عينة على طبقين متطابقين، أحدهما يحتوي على مضاد حيوي والآخر لا يحتوي عليه. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق ملحوظ في عدد المستعمرات على الطبقين. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق التي تحتوي على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنةً بالأطباق الخالية منه. تحقق من سلامة المستنسخ عن طريق تحليل إنزيمات التقييد و/أو تسلسل الإطار المفتوح للقراءة (ORF). إذا كانت السمية هي المشكلة، فإن السلالات المُعبرة عن lysY ستوفر استقرارًا للمستنسخ. س: ما هي الحلول/الوصفات (C2527)؟ ج: المحاليل/الوصفات SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. أجار LB: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل (TE). عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءتها بعد يومين، و99.6% منها بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان فعالاً تماماً. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المضاف إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (بدلاً من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2527H وNEB #C2527I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix and Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: ما الفرق بين خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة BL21 وBL21(DE3)؟ أ: كلا السلالتين من النوع B، وبالتالي تفتقران إلى بروتياز Lon (في السيتوبلازم) وبروتياز OmpT (في الغشاء الخارجي). وعليه، تُفضّل سلالات B عمومًا لإنتاج البروتينات المؤتلفة. يشير رمز DE3 إلى أن السلالتين تحتويان على الليزوجين λDE3 الذي يحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 تحت سيطرة محفز lacUV5. يُعدّ IPTG ضروريًا لتحفيز إنتاج بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 إلى أقصى حد، وذلك لإنتاج الجينات المؤتلفة المستنسخة أسفل محفز T7. تُناسب سلالة BL21(DE3) إنتاج الجينات من محفز T7 أو T7-lac أو المحفزات التي يتعرف عليها بوليميراز الحمض النووي الريبي لبكتيريا الإشريكية القولونية، مثل: lac، وtac، وtrc، وParaBAD، وPrhaBAD، بالإضافة إلى محفز T5. لاحظ أن سلالة BL21 لا تحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، وبالتالي فهي مناسبة فقط للتعبير الجيني من المحفزات التي يتعرف عليها بوليميراز الحمض النووي الريبي لبكتيريا الإشريكية القولونية، مثل: lac، وtac، وtrc، وParaBAD، وPrhaBAD، بالإضافة إلى محفز T5. س: كيف يُخزن وسط نمو SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع الخلايا المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه في درجة حرارة الغرفة فقط، وإلا ستتكون بلورات. س: هل يخضع التعبير عن T7 لتثبيط الكاتابوليت في سلالة BL21(DE3) والسلالات المشتقة منها؟ ج: يحمل طليعة العاثية لامدا DE3 جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7gene1). ويتحكم محفز lacUV5 في التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. لذلك، ستؤدي إضافة الجلوكوز إلى تثبيط الكاتابوليت، وسيتم التحكم بشكل أفضل في التعبير الأساسي للبروتين من نواقل محفز T7 عند وجود الجلوكوز في الوسط. وعندما يكون الجلسرين هو المصدر الأساسي للكربون، فلا ينبغي أن يكون هناك أي تأثير على التعبير الأساسي عن T7.