نيو إنجلاند بيولابس، C2529H، NiCo21(DE3) بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة: تنقية النيكل (علامة الهيستيدين)، التعبير عن T7، تنقية التقارب، التطبيقات : التعبير عن البروتين الموسوم بالهيستيدين وتنقيته، علامات تنقية التقارب والتعبير، التعبير عن T7، المواصفات: مضاد حيوي لاختيار البلازميد ، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة: س: هل تقدم شركة نيو إنجلاند بيولابس سلالات من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة والمناسبة للتعبير عن البروتين؟ ج: نعم، لدينا العديد من السلالات للتعبير عن البروتين. يُقدَّم السلالة BL21(DE3) (NEB #C2527) للتعبير الروتيني باستخدام T7، بينما تُقدَّم السلالة BL21 (NEB #C2530) للتعبير غير المعتمد على T7. أما السلالة NEBExpress (NEB #C2523) فهي مشتق مُحسَّن من BL21، بينما تُتيح السلالة NEB Express Iq (NEB #C3037) تحكمًا دقيقًا في التعبير من نواقل تحتوي على مُحفِّزات lac أو tac أو trc أو T5-lac0. وتُعدّ سلالتا T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) وT7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) مشتقات مُحسَّنة من BL21(DE3). تُتيح سلالة lacIq تحكمًا أدق في التعبير. وتتوفر كلتا السلالتين مع خاصية lysY لتحكم استثنائي في التعبير (T7 Express lysY، NEB #C3010 وT7 Express lysY/Iq، NEB #C3013). تُقدّم شركة NEB أيضًا سلالات SHuffle™ القادرة على طي البروتينات بشكل صحيح، حتى تلك التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد متعددة في السيتوبلازم. يُمكن استخدام SHuffle™ Express (NEB #C3028H) مع مُحفّزات غير T7، أو SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) مع نواقل التعبير عن مُحفّز T7. أما للتعبير عن مُحفّز T7 السام، فإن SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) هو الخيار الأمثل. تُقدّم هذه السلالات الثلاث أيضًا كسلالات K12: SHuffle™ (NEB #C3025H)، وSHuffle™ T7 (NEB #C3026H)، وSHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). يتوفر Lemo21(DE3) (NEB #C2528) للتعبير القابل للضبط عن أهداف صعبة، مثل البروتينات الغشائية، والبروتينات السامة، والبروتينات المعرضة للتعبير غير الذائب. تم تصميم NiCo21(DE3) (NEB #C2529) للتعبير الروتيني عن البروتينات الموسومة بالهيستيدين وتنقيها. س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2529)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. أجار LB: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار. س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا ينمو أي شيء في المزرعة السائلة (C2529)؟ ج: غالبًا ما تعود هذه النتيجة إلى التعبير القاعدي لمنتج الجين المستهدف، وهو ما يضر بحيوية الخلية. التعبير القاعدي للبروتين المستهدف في NiCo21(DE3) مطابق للتعبير القاعدي في BL21(DE3). تسمح بعض أنظمة النواقل (وخاصةً تلك التي تستخدم مُحفِّز T7) بالتعبير الجيني دون الحاجة إلى مُحفِّز. في حال تطلّب الأمر تنظيمًا دقيقًا لتعبير T7، يُنصح باستخدام سلالة تُعبِّر عن lysY: T7 Express lysY (NEB #C3010) يُنتج lysY طفرةً من الليزوزيم T7 ترتبط ببوليميراز RNA T7، مما يُقلِّل من التعبير الأساسي للبروتين المستهدف. عند التحفيز، يُزيل بوليميراز RNA T7 المُصنَّع حديثًا الليزوزيم، مما يؤدي إلى التعبير عن البروتين المستهدف. T7 Express lysY/Iq (NEB #C3013) يُعبِّر عن lysY بالإضافة إلى الإفراط في التعبير عن lacI لكبح التعبير الأساسي لبوليميراز RNA T7. Lemo21(DE3) (NEB #C2528) BL21(DE3) يحتوي على نظام Lemo™. يتم تعديل تعبير LysY بواسطة L-رامنوز، مما يجعل التعبير عن بروتين T7 مُنظَّمًا بدقة وقابلًا للتعديل. س: لماذا يكون البروتين المُحفَّز غير قابل للذوبان (C2529)؟ ج: غالبًا ما يؤدي التعبير عن T7 إلى إنتاج كميات كبيرة جدًا من البروتين، مما قد يجعل البروتين المستهدف غير قابل للذوبان. الحلول المُحتملة هي: التحفيز عند درجة حرارة منخفضة (حتى 15 درجة مئوية طوال الليل)، تقليل تركيز IPTG إلى 10-40 ميكرومولار، التحفيز في وقت مُبكر من مرحلة النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4) وحصاد الخلايا مُبكرًا، إنشاء بنية تعبير حيث يتم دمج البروتين المستهدف مع بروتين ربط المالتوز (NEB #E8200). س: لماذا لا يظهر أي بروتين بواسطة SDS-PAGE أو لا يوجد نشاط (C2529)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا فقدت بلازميد التعبير أو تم حذف عناصر من بلازميد التعبير. قم بزراعة الخلايا لتحفيز البروتين. قبل التحفيز مباشرةً، قم بزراعة عينة على طبقين مُكررين مع وبدون اختيار المضاد الحيوي. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق كبير بين عدد المستعمرات على الأطباق. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق المحتوية على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنةً بالأطباق الخالية منه. إذا لم يُحافظ على بلازميد التعبير عن طريق الانتقاء الدوائي، فإن سلالات lysY ستُحسّن استقرار المستنسخ. تحقق من سلامة المستنسخ بتحليل إنزيمات التقييد و/أو تسلسل الإطار المفتوح للقراءة (ORF). س: ما هي خصائص السلالة (C2529)؟ ج: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتين. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7: يُشفّر جين T7 1 بواسطة طليعة العاثية لامدا DE3 الموجودة داخل الكروموسوم. يُعبّر عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 من مُحفّز lacUV5، وهو أقل حساسيةً لتثبيط الكاتابوليت من مُحفّز lac الأصلي. وبالتالي، قد تُظهر سلالات DE3 تعبيرًا غير مُحفّز عن البروتين المستهدف. على الرغم من أن العاثية λ DE3 تكون عادةً كامنة في كروموسوم الخلية المضيفة، إلا أن تحفيز استجابة SOS قد يحدث نتيجةً لتعبير بروتينات تُلحق الضرر بكروموسوم الإشريكية القولونية، سواءً بشكل مباشر أو غير مباشر. وقد يؤدي ذلك إلى تحلل الخلية. لا تحمل سلالات T7 Express العاثية الأولية DE3، وبالتالي فهي تتحمل استجابة SOS بشكل أفضل. نقص البروتياز ([lon] ompT): تفتقر سلالات الإشريكية القولونية B بشكل طبيعي إلى بروتياز Lon، الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد بروتياز OmpT على سطح الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالات K-12 وB، ويُفترض أنه يساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. الخلايا التي تفتقر إلى كلا هذين البروتيازين أكثر استجابةً لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. العاثية المقاومة T1 (fhuA2): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. glmS6Ala: طُفر جين glmS (إنزيم غلوكوزامين سينثيتاز)، ويحتوي بروتين GlmS المُعبَّر عنه (67 كيلو دالتون) على ستة استبدالات من الهيستيدين إلى الألانين (المواقع 62، 65، 432، 436، 466، 467). لا يرتبط بروتين GlmS المتحوّر براتنج Ni-NTA في وجود محلول إيميدازول بتركيز 20 ملي مولار للربط/الغسل، بينما يرتبط بروتين GlmS الطبيعي براتنج Ni-NTA ولا يُفصل إلا عندما يكون تركيز الإيميدازول بين 55 و80 ملي مولار (1). تم دمج جين arnA (تعديل الليبيد A) مع إطار قراءة مفتوح (ORF) من بكتيريا B. circulans يُشفّر نطاق ربط الكيتين. يبلغ وزن البروتين المدمج المُعبَّر عنه 82 كيلو دالتون، بينما يبلغ وزن بروتين ArnA الطبيعي 74 كيلو دالتون. تم دمج جين can (أنيدراز الكربونيك) مع إطار قراءة مفتوح (ORF) من بكتيريا B. circulans يُشفّر نطاق ربط الكيتين. يبلغ وزن البروتين المدمج المُعبَّر عنه 32 كيلو دالتون، بينما يبلغ وزن الأنهيدراز الكربوني الطبيعي 25 كيلو دالتون. تم دمج جين slyD (بروليل إيزوميراز من نوع FKBP) مع إطار قراءة مفتوح (ORF) من بكتيريا B. circulans يُشفِّر نطاق ربط الكيتين. يبلغ وزن البروتين المدمج المُعبَّر عنه 28 كيلو دالتون. مع ذلك، تبلغ الكتلة الظاهرية لبروتين CBD المدمج حوالي 35 كيلو دالتون عند تحليله بواسطة SDS-PAGE. تبلغ الكتلة المحسوبة لبروتين SlyD الطبيعي 21 كيلو دالتون، بينما تبلغ الكتلة الظاهرية 28 كيلو دالتون. يُعد كل من بروتين GlmS(6Ala) والبروتينات الموسومة بـ CBD وظيفيين في الجسم الحي وفقًا للاختبارات التي أُجريت في مختبرات نيو إنجلاند بيولابس. س: هل يُمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلًا من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة من نوع NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وفقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2529H)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix & Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا تتطلب هذه الطريقة صدمة حرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. وقد لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات. مع ذلك، تكون مستعمرات NEB أكبر حجمًا عند استخدام نفس فترة الحضانة. س: كيف يُخزَّن وسط نمو SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع الخلايا المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المُرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه في درجة حرارة الغرفة فقط وإلا ستتكون بلورات. س: هل يخضع التعبير عن T7 لتثبيط الكاتابوليت في BL21(DE3) والسلالات المشتقة؟ ج: يحمل طليعة العاثية لامدا DE3 جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7gene1). يتم التحكم في التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بواسطة محفز lacUV5. لذلك، ستؤدي إضافة الجلوكوز إلى تثبيط الاستقلاب، وسيتم التحكم بشكل أفضل في التعبير الأساسي للبروتين من نواقل محفز T7 عند وجود الجلوكوز في الوسط. عندما يكون الجلسرين هو المصدر الأساسي للكربون، فلن يكون هناك أي تأثير على التعبير الأساسي لـ T7. س: ما هي بلازميدات التعبير التي يمكن استخدامها مع NiCo21(DE3)؟ ج: تم تصميم NiCo21(DE3) للتعبير عن البروتين من النواقل التي تشفر محفز العاثية T7. ومع ذلك، فإن NiCo21(DE3) متوافق أيضًا مع أي محفز يتعرف عليه بوليميراز الحمض النووي الريبي E. coli مثل Plac وPtac وPtrc وParaBAD وPrhaBAD وPT5-lac. يتم توفير ناقل pUC19 كعنصر تحكم لاختبار كفاءة التحويل. يشفر pUC19 محفز lac، ولكن نظرًا لعدد النسخ العالي، لا نوصي باستخدام pUC19 للتعبير عن البروتين.