نيو إنجلاند بيولابس، C2530H، BL21 بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة: التعبير غير T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، التطبيقات ، التعبير غير T7، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات التعبير عن البروتين ، المضاد الحيوي لاختيار البلازميد، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة : س: هل توفر شركة نيو إنجلاند بيولابس سلالات من الإشريكية القولونية المؤهلة والمناسبة للتعبير عن البروتين؟ ج: نعم، لدينا العديد من السلالات للتعبير عن البروتين. يُقدَّم السلالة BL21(DE3) (NEB #C2527) للتعبير الروتيني باستخدام T7، بينما تُقدَّم السلالة BL21 (NEB #C2530) للتعبير غير المعتمد على T7. أما السلالة NEBExpress (NEB #C2523) فهي مشتق مُحسَّن من BL21، بينما تُتيح السلالة NEB Express Iq (NEB #C3037) تحكمًا دقيقًا في التعبير من نواقل تحتوي على مُحفِّزات lac أو tac أو trc أو T5-lac0. وتُعدّ سلالتا T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) وT7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) مشتقات مُحسَّنة من BL21(DE3). تُتيح سلالة lacIq تحكمًا أدق في التعبير. وتتوفر كلتا السلالتين مع خاصية lysY لتحكم استثنائي في التعبير (T7 Express lysY، NEB #C3010 وT7 Express lysY/Iq، NEB #C3013). تُقدّم شركة NEB أيضًا سلالات SHuffle™ القادرة على طي البروتينات بشكل صحيح، حتى تلك التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد متعددة في السيتوبلازم. يُمكن استخدام SHuffle™ Express (NEB #C3028H) مع مُحفّزات غير T7، أو SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) مع نواقل التعبير عن مُحفّز T7. أما للتعبير عن مُحفّز T7 السام، فإن SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) هو الخيار الأمثل. تُقدّم هذه السلالات الثلاث أيضًا كسلالات K12: SHuffle™ (NEB #C3025H)، وSHuffle™ T7 (NEB #C3026H)، وSHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). يتوفر Lemo21(DE3) (NEB #C2528) للتعبير القابل للضبط عن أهداف صعبة، مثل البروتينات الغشائية، والبروتينات السامة، والبروتينات المعرضة للتعبير غير الذائب. تم تصميم سلالة NiCo21(DE3) (NEB #C2529) للتعبير الروتيني عن البروتينات الموسومة بالهيستيدين وتنقيها. س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2530)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. أجار LB: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار. س: ما هي خصائص السلالة (C2530)؟ أ: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتين. نقص البروتياز ([lon] ompT): تفتقر سلالات الإشريكية القولونية B بشكل طبيعي إلى بروتياز lon، الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد بروتياز OmpT على سطح الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالات K-12 وB، ويُفترض أنه يُساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. الخلايا التي تفتقر إلى كلا البروتيازين أكثر استجابة لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. مقاومة العاثية T1 (fhuA2): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يُكسب حذف هذا الجين مقاومة لهذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا ينمو أي شيء في المزرعة السائلة (C2530)؟ ج: قد يعود ذلك إلى التعبير القاعدي لمنتج الجين المستهدف، وهو ما يضر بحيوية الخلية. في حال الاشتباه بسمية البروتين المستهدف، يُنصح باستخدام سلالات تُفرط في إنتاج LacI (مثل NEB #C3037 NEB Express Iq Competent E. coli) مع النواقل التي تحتوي على مُحفز tac أو trc أو lac أو lacUV5 أو T5-lacO. س: لماذا يكون البروتين المُحفز غير قابل للذوبان (C2530)؟ ج: غالبًا ما يؤدي التعبير عالي المستوى عن الجينات غير الأصلية إلى عدم ذوبان البروتين المستهدف. الحلول المُحتملة هي: التحفيز عند درجة حرارة منخفضة (حتى 15 درجة مئوية طوال الليل)، تقليل تركيز IPTG إلى 40 ميكرومولار، التحفيز في وقت مُبكر من مرحلة النمو (OD600 = 0.3–0.4) وحصاد الخلايا في وقت مُبكر. أنشئ بنية تعبيرية حيث يتم دمج البروتين المستهدف مع بروتين ربط المالتوز (نظام دمج وتنقية البروتين pMAL، NEB #E8200). س: لماذا لا يظهر أي بروتين على الهلام أو لا يوجد نشاط (C2530)؟ ج: تحقق من السمية: قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا فقدت بلازميد التعبير أو تم حذف عناصر منه. قم بزراعة الخلايا للتعبير عن البروتين. قبل التحفيز مباشرة، ازرع عينة على طبقين متطابقين مع وبدون اختيار المضاد الحيوي. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق كبير في عدد المستعمرات على الأطباق. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق التي تحتوي على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنة بالأطباق التي لا تحتوي على المضاد الحيوي. تحقق من سلامة المستنسخ عن طريق تحليل إنزيمات التقييد و/أو تسلسل الإطار المفتوح للقراءة. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. يؤدي التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى انخفاض ملحوظ في كفاءة التحويل. عند اختبارها على خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. كما فقدت 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2350H)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix & Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كليهما ينتج أعدادًا مماثلة من المستعمرات. مع ذلك، تكون مستعمرات NEB أكبر حجمًا عند استخدام نفس فترة الحضانة. س: ما الفرق بين خلايا الإشريكية القولونية BL21 وBL21(DE3) المؤهلة؟ ج: كلا السلالتين من السلالات B، وبالتالي تفتقران إلى بروتياز Lon (في السيتوبلازم) وبروتياز OmpT (في الغشاء الخارجي). وعليه، تُفضل السلالات B عمومًا للتعبير عن البروتينات المؤتلفة. يشير رمز DE3 إلى أن السلالات المعنية تحتوي على حاملة λDE3 التي تحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 تحت سيطرة محفز lacUV5. يُعد IPTG ضروريًا لتحفيز التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 إلى أقصى حد، وذلك للتعبير عن الجينات المؤتلفة المستنسخة أسفل محفز T7. يُعدّ السلالة BL21(DE3) مناسبة للتعبير الجيني من مُحفّز T7 أو T7-lac أو المُحفّزات التي يتعرّف عليها بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية، مثل: lac، وtac، وtrc، وParaBAD، وPrhaBAD، بالإضافة إلى مُحفّز T5. يُرجى ملاحظة أن السلالة BL21 لا تحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، وبالتالي فهي مناسبة فقط للتعبير الجيني من المُحفّزات التي يتعرّف عليها بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية، مثل: lac، وtac، وtrc، وParaBAD، وPrhaBAD، بالإضافة إلى مُحفّز T5. س: كيف يُمكنني تخزين وسط نمو الخلايا SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع الخلايا المُؤهّلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مُستقل، يُوصى بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أيّهما أفضل؟ ج: يُمكن تخزين وسط SOC في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة، وذلك حسب سرعة استخدامه. يُعدّ التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). أما للتخزين طويل المدى، فنوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو Outgrowth Medium 1.5 المُرفق مع NEB #C2987R (لوحة واحدة بـ 384 بئرًا) يجب تخزينه في درجة حرارة الغرفة فقط، وإلا ستتكون بلورات.