نيو إنجلاند بيولابس، C2566I، T7 Express Competent E. coli (عالية الكفاءة)

الفئات ذات الصلة: التعبير عن T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، تطبيقات التعبير عن T7، ربط الببتيد، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات المضاد الحيوي لاختيار البلازميد ، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن: يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة : س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2566)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون) 0.5% مستخلص خميرة 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز LB أجار: 1% تريبتون 0.5% مستخلص خميرة 0.17 مولار كلوريد الصوديوم 1.5% أجار س: ما هي خصائص السلالة (C2566)؟ ج: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتين. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (lacZ::T7 gene1) يحتوي T7-Express على جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 مُدرج في أوبيرون اللاكتوز على كروموسوم الإشريكية القولونية، ويتم التعبير عنه تحت سيطرة مُحفز اللاكتوز. يُتيح هذا التكوين تحفيزًا مُتحكمًا به لإنزيم البوليميراز، وبالتالي تحكمًا قابلًا للتحفيز في نسخ الجينات الواقعة أسفل مُحفز T7. يوفر هذا النظام مزايا مُحتملة مُقارنةً بسلالات مثل BL21(DE3)، التي تحمل بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على طليعة عاثية مُتَحَوِّلة. على الرغم من أن λDE3 يكون عادةً خاملًا في كروموسوم العائل، إلا أن تحفيز سلسلة SOS قد يحدث نتيجةً للتعبير عن بروتينات تُلحق الضرر بكروموسوم الإشريكية القولونية، إما بشكل مباشر أو غير مباشر. قد يؤدي هذا إلى تحلل الخلية. نقص البروتياز ([lon] ompT): تفتقر سلالات الإشريكية القولونية B بشكل طبيعي إلى بروتياز lon الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد إنزيم OmpT البروتيني على سطح بكتيريا الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من السلالتين K-12 وB، ويُفترض أنه يُساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. وتكون الخلايا التي تفتقر إلى هذين الإنزيمين البروتينيين أكثر استجابةً لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. ويمكن أن تُساعد طفرات جينات أخرى في التخفيف من الآثار الضارة أحيانًا لعيوب هذه الإنزيمات البروتينية (مثل sulA، أدناه). التعافي من تلف الحمض النووي (sulA11): تستطيع خلايا الإشريكية القولونية تحمل قدر كبير من تلف الحمض النووي المزمن طالما سُمح لعملية الإصلاح بالاستمرار. وتتأثر هذه القدرة سلبًا إذا لم تتمكن الخلايا من الانقسام بعد الإصلاح. في خلايا lon-، يتراكم بروتين SulA، وهو مُثبط لانقسام الخلايا، مما يجعل الخلايا شديدة الحساسية لتلف الحمض النووي. وتسمح طفرة sulA المُدخلة في سلالة T7 Express للخلايا بالانقسام بشكل طبيعي أكثر في غياب إنزيم Lon البروتيني. نقص الإندونوكلياز I: (endA) يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضّرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، مما يُحسّن جودة تحضيرات البلازميدات بشكل ملحوظ. نقص التقييد: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10) تحمل سلالات الإشريكية القولونية B من النوع البري إندونوكلياز تقييد من النوع الأول، والذي يقطع الحمض النووي عند الموقع TGA(N8)TGCT. على الرغم من أن الحمض النووي للإشريكية القولونية محمي من التحلل بواسطة ناقل ميثيل مُناسب، إلا أن الحمض النووي الغريب سيُقطع عند هذه المواقع. يؤدي الحذف المذكور أعلاه إلى إزالة كل من ناقل الميثيل والإندونوكلياز. نقص تقييد الميثيل: (Δ((mcrC-mrr)114::IS10 و R(mcr-73::miniTn10--TetS)2): تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات المشفرة بواسطة mcrA و mcrBC و mrr، والتي تقوم بقطع الحمض النووي ذي أنماط الميثيل الموجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. تم تعطيل جميع إنزيمات Mcr الثلاثة و Mrr في T7 Express، مما يسمح بإدخال الحمض النووي حقيقي النواة ذي الأصل الجينومي (مثل المكتبات الأولية) إذا لزم الأمر. مقاومة العاثية T1: (fhuA2) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا يوجد نمو في المزرعة السائلة؟ (C2566)؟ ج: على الرغم من أن التعبير عن T7 مُنظَّم بإحكام، فقد يكون هناك مستوى منخفض من التعبير القاعدي في مضيف T7 Express. إذا كان من المحتمل حدوث سمية للبروتين المُعبَّر عنه، فيجب إجراء تحويل بلازميد التعبير في أحد السلالات التالية: » T7 Express Iq: يؤدي الإفراط في التعبير عن مثبط LacI إلى تقليل التعبير القاعدي لبوليميراز RNA T7. » T7 Express lysY: ينتج lysY ليزوزيم T7 طافرًا يرتبط ببوليميراز RNA T7، مما يقلل من التعبير القاعدي للبروتين المستهدف. عند التحفيز، يقوم بوليميراز RNA T7 المُصنَّع حديثًا بمعايرة الليزوزيم ويؤدي إلى التعبير عن البروتين المستهدف. » يجمع T7 Express Iq/lysY بين التأثيرين السابقين. قد يؤدي الحضانة عند 30 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة أيضًا إلى تخفيف مشاكل السمية. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من تركيز المضاد الحيوي (اختبره باستخدام بلازميد تحكم). س: لماذا لا يظهر أي بروتين على الهلام أو لا يوجد نشاط؟ (C2566)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا قد تخلصت من عناصر في بلازميد التعبير أو حذفتها. » قم بزراعة الخلايا لتحفيز إنتاج البروتين. قبل التحفيز مباشرة، ازرع عينة على طبقين متطابقين مع وبدون اختيار المضاد الحيوي. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق كبير في عدد المستعمرات على الأطباق. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق التي تحتوي على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنة بالأطباق التي لا تحتوي على المضاد الحيوي. » إذا كانت السمية هي المشكلة، فاختبر مضيفي Iq و lysY المذكورين أعلاه لتقليل مستوى التعبير الأساسي. س: لماذا يكون البروتين المحفز غير قابل للذوبان (C2566)؟ ج: تحقق من عدم الذوبان - هذا مهم لأن تعبير T7 غالبًا ما يؤدي إلى إنتاج عالٍ جدًا من البروتين مما قد يؤدي إلى أن يصبح البروتين المستهدف غير قابل للذوبان. الحلول المحتملة لذلك هي: » التحفيز في درجات حرارة منخفضة (تصل إلى 12-15 درجة مئوية طوال الليل) » تقليل تركيز IPTG إلى 0.01 - 0.1 ملي مولار » التحفيز لفترة أقل الوقت (حتى 15 دقيقة فقط) » التحفيز في وقت مبكر من النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4) س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل (TE). عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% من كفاءة التحويل بعد أسبوع واحد من التخزين عند -20 درجة مئوية. س: ما الفرق بين NEB #C2566H وNEB #C2566I؟ ج: إنها نفس الخلايا بنفس الكفاءة ولكنها متوفرة بأشكال مختلفة. يتم تعبئة C2566H مع 20 أنبوب تحويل للاستخدام الفردي، تحتوي كل أنبوبة على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. تأتي سلالة C2566I في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، كل منها يحتوي على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. تحتوي كل أنبوبة على عدد كافٍ من الخلايا لإجراء 4 عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. يُعد استخدام سلالة C2566I فعالاً من حيث التكلفة عند إجراء 3 أو 4 عمليات تحويل في وقت واحد. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2566H وNEB #C2566I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 10-20 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة T7 Express (NEB #C2566H وNEB #C2566I). توقع انخفاضًا بنسبة 50% تقريبًا في كفاءة التحويل عند تعريض الخلايا لصدمة حرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المدة اللازمة لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2566H وNEB #C2566I)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع خلايا T7 Express المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. توقع انخفاضًا بنسبة 30% تقريبًا في كفاءة التحويل عند الحضانة لمدة 10 دقائق (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: هل يتوافق T7 Express (NEB #C2566H وNEB #C2566I) مع إجراءات التحفيز الذاتي؟ ج: لا يتوافق T7 Express مع إجراءات التحفيز الذاتي. في أوساط التحفيز الذاتي، يعمل اللاكتوز على تحفيز التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 عند تحويله إلى ألو-لاكتوز بواسطة بيتا-جالاكتوزيداز (ناتج جين lacZ). لذلك، يجب إجراء التحفيز الذاتي باستخدام سلالات تحتوي على أوبيرون لاك سليم. (1) في سلالة T7 Express، يُعطّل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (جين T7 1) جين lacZ، مما يؤدي إلى تعطيل بيتا-جالاكتوزيداز. لذلك، لا يُنصح باستخدام سلالة T7 Express في إجراءات التحفيز الذاتي. نوصي باستخدام السلالات المضيفة BL21(DE3) (NEB #C2527H وNEB #C2527I) أو NiCo21(DE3) (NEB #C2529H) لإجراءات التحفيز الذاتي. (1) Studier, FW (2005) Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures Protein Expr. Purif. 41, 207-34. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع أنبوب 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: حجم الحمض النووي الذي يجب إضافته إلى الخلايا المؤهلة تؤثر الخلايا على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (البلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2566H وNEB #C2566I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية سنتان من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix and Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix and Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا والزرع. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت شركة NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: ما الفرق بين T7 Express (NEB #C2566H/I) وBL21(DE3) (NEB #C2527H/I)؟ ج: يحتوي T7-Express على جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 مُدرجًا في أوبيرون اللاكتوز على كروموسوم الإشريكية القولونية، ويتم التعبير عنه تحت سيطرة مُحفز اللاكتوز. يوفر هذا التكوين تحفيزًا مُتحكمًا فيه للبوليميراز، وبالتالي، تحكمًا قابلًا للتحفيز في نسخ الجينات الواقعة أسفل مُحفز T7. يوفر هذا النظام مزايا محتملة على سلالات مثل BL21(DE3)، التي تحمل بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على طليعة عاثية مُتَحَوِّلة. على الرغم من أن λDE3 يكون عادةً خاملًا في العائل قد يحدث تحفيز سلسلة تفاعلات SOS نتيجةً لتعبير بروتينات تُلحق الضرر بكروموسوم الإشريكية القولونية، سواءً بشكل مباشر أو غير مباشر. وقد يؤدي ذلك إلى تحلل الخلية. س: كيف يُخزَّن وسط نمو SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع خلاياي المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في 4 درجات مئوية. أيّهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المُرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه في درجة حرارة الغرفة فقط، وإلا ستتكون بلورات. س: هل يخضع التعبير عن T7 لتثبيط الكاتابوليت في NEB T7 Express أو SHuffle؟ السلالات؟ ج: تم استنساخ جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 في أوبيرون اللاكتوز الكروموسومي. وبما أن التعبير الجيني يُتحكم فيه بواسطة أوبيرون اللاكتوز الطبيعي، فإن إضافة الجلوكوز ستؤدي إلى تثبيط استقلابي. وبالتالي، سيكون التعبير البروتيني الأساسي من نواقل محفز T7 أكثر تحكمًا عند وجود الجلوكوز في الوسط. أما عندما يكون الجلسرين هو المصدر الرئيسي للكربون، فلا يُفترض أن يكون هناك أي تأثير على أوبيرون اللاكتوز.