نيو إنجلاند بيولابس، C2925H، بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة dam-/dcm-

نقص في إنزيم ميثيل ترانسفيراز. الفئات ذات الصلة: استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة. التطبيقات: حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة. مواصفات التحويل: مضاد حيوي لاختيار البلازميد. المضادات الحيوية لاختيار البلازميد. تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن: يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكنني تحويل الحمض النووي غير الميثيلي إلى بكتيريا الإشريكية القولونية (C2925) المؤهلة dam-/dcm-؟ ج: نعم. تم تحويل pUC19 وتكاثره في NEB 5-alpha (pUC19-C2987) وفي dam-/dcm- (pUC19-C2925). تم تنقية البلازميد بشكل منفصل ثم تحويله إلى بكتيريا الإشريكية القولونية (NEB #C2925H) المؤهلة لنقل جينات dam-/dcm-. بلغت كفاءة التحويل للحمض النووي الميثيلي pUC19-C2987 4.54 × 10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من pUC19. أما كفاءة التحويل للحمض النووي غير الميثيلي pUC19-C2925 فبلغت 1.09 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من pUC19، أي أعلى بـ 24 مرة من كفاءة التحويل للحمض النووي الميثيلي. س: هل توفر شركة نيو إنجلاند بيولابس سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة خالية من إنزيم ميثيل ترانسفيراز؟ ج: نعم، بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة لنقل جينات dam-/dcm- (NEB #C2925H) هي خلايا إشريكية قولونية مؤهلة كيميائيًا تفتقر إلى إنزيم ميثيل ترانسفيراز، وهي مناسبة لنمو البلازميدات الخالية من مثيلة dam وdcm. س: ما هي المدة المثلى لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2925H وNEB #C2925I)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع الخلايا المؤهلة dam-/dcm- على الجليد لمدة 30 دقيقة. عند اختبارها باستخدام pUC19، لم تؤثر مدة الحضانة البالغة 20 دقيقة سلبًا على كفاءة التحويل (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: هل سلالة dam-/dcm- (NEB #C2925H/C2925I) مقاومة للكاناميسين؟ ج: تتميز سلالة NEB #C2925H/C2925I بتردد منخفض ولكنه ملحوظ لطفرات مقاومة الكاناميسين. وقد لاحظنا عددًا منخفضًا ومتغيرًا من طفرات مقاومة الكاناميسين التلقائية في هذه السلالة، وكذلك في سلالات dam-/dcm- أخرى متوفرة تجاريًا (Invitrogen INV110). في كلا السلالتين، تظهر مستعمرات صغيرة على أطباق كاناميسين بتردد يتراوح بين خلية واحدة لكل 10⁶ خلية إلى خلية واحدة لكل 10⁷ خلية. لا تنمو هذه المستعمرات الصغيرة عند إعادة زرعها على طبق كاناميسين جديد. لا يُفترض أن يُمثل هذا المستوى من المقاومة الأساسية مشكلةً للتحويل الروتيني للبلازميدات الحاملة لجين مقاومة كاناميسين. سبب ظهور مقاومة كاناميسين غير مكتملة، والذي يعتمد على السلالة، غير معروف. س: هل يكون مردود الحمض النووي أقل باستخدام سلالة dam-/dcm- (C2925)؟ ج: لا. تم تحويل البلازميد pUC19 إلى بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة dam-/dcm- (NEB #C2925H) وبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha F´ Iq (NEB #C2992H)، وتم تنقية البلازميد جنبًا إلى جنب. لم يكن هناك فرق بين هاتين السلالتين من حيث جودة الحمض النووي أو مردوده. تم أيضًا تحويل البلازميد pBIND إلى سلالتيّ الإشريكية القولونية (NEB #C2925H) وNEB 10-beta (NEB #C3019H) القادرتين على نقل جينات dam-/dcm-، وتم تنقية البلازميد في كلتيهما. لم يُلاحظ أي فرق بين السلالتين من حيث جودة الحمض النووي أو كميته. نوصي بتلقيح المستعمرات النامية حديثًا لتكاثر البلازميد. س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2925)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. أجار LB: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار. س: ما هي خصائص السلالة (C2925)؟ أ: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة فرعية لاستنساخ البروتينات. تظهر الأنماط الجينية المسؤولة عن هذه الخصائص بين قوسين. سلالة dam وdcm ناقصة المثيلة (dam13::Tn9 (CamR)، dcm-6): تحتوي معظم سلالات الإشريكية القولونية المختبرية على كلٍ من مثيلاز Dam ومثيلاز Dcm. ينقل مثيلاز Dam مجموعة ميثيل إلى الأدينين في التسلسل GATC. يقوم مثيلاز Dcm بمثيلة بقايا السيتوزين الداخلية في التسلسلين CCAGG وCCTGG. لن تقوم العديد من إنزيمات القطع المحددة بقطع المواقع التي تحتوي على هذه القواعد المعدلة. تسمح سلالة damdcm بنمو وتنقية الحمض النووي الخالي من مثيلة Dam وDcm. سلالة ناقصة الإندونوكلياز I: (endA1): يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إنزيم قطع محدد غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز ويمكن أن تحسن بشكل كبير جودة تحضيرات البلازميد. نقص التقييد: (hsdR2) تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إنزيم التقييد EcoK من النوع الأول الذي يقطع الحمض النووي في المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). على الرغم من أن الحمض النووي للإشريكية القولونية محمي من التحلل بواسطة ناقل ميثيل خاص به، إلا أن الحمض النووي الغريب سيُقطع في هذه المواقع. طفرة hsdR2 المذكورة أعلاه تُزيل إنزيم التقييد. نقص التقييد الميثيلي الجزئي: (mcrA، mcrB1) تمتلك الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات، mcrA وmcrB وmrr، التي تقطع الحمض النووي بأنماط الميثيل الموجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. لن يُمَثْيَل الحمض النووي المُشتق من شظايا PCR أو cDNA أو الحمض النووي الذي تم استنساخه سابقًا في الإشريكية القولونية في هذه المواقع ولن يُقطع. تحتوي هذه السلالة على إنزيم Mrr وظيفي وقد لا مناسبة للاستنساخ المباشر للحمض النووي حقيقي النواة. مقاومة لفيروس T1: (fhuA31) يتطلب فيروس T1، وهو فيروس شديد الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي يكون مُعديًا. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من الفيروسات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: ما الفرق بين NEB #C2925H وNEB #C2925I؟ ج: إنهما نفس الخلايا بنفس الكفاءة ولكنهما متوفرتان بأشكال مختلفة. يتم تعبئة C2925H في 20 أنبوب تحويل للاستخدام مرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرة إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. يتم تعبئة C925I في 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة. قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على خلايا كافية لأربع عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. إذا كنت تُجري ثلاث أو أربع عمليات تحويل في المرة الواحدة، فإن استخدام سلالة C2925I يُعدّ خيارًا اقتصاديًا. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها، لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2925H وNEB #C2925I)؟ ج: تُؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة dam-/dcm- (NEB #C2925H وNEB #C2925I). لا تتأثر كفاءة التحويل بشكل كبير بتغيير وقت الصدمة الحرارية ضمن نطاق 20-60 ثانية. توقع خسارة تقارب 20% في كفاءة التحويل عند استخدام الصدمة الحرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: أي سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة يجب أن أستخدمها للاستنساخ العام؟ ج: NEB سلالة الإشريكية القولونية 5-ألفا المؤهلة (NEB #C2987) هي مشتق عالي الكفاءة من سلالة DH5α™، وهي سلالة الاستنساخ القياسية في هذا المجال. تسمح سلالتا الإشريكية القولونية NEB Turbo المؤهلة (NEB #C2984) وNEB 5-ألفا F´Iq المؤهلة (NEB #C2992) باستنساخ الجينات التي قد تكون سامة بفضل التحكم الدقيق في التعبير بواسطة lacIq، وهما مناسبتان للفحص الأزرق/الأبيض. توفر سلالة الإشريكية القولونية NEB Turbo المؤهلة (NEB #C2984) سرعة فائقة في عمليات التحويل، حيث تظهر المستعمرات المرئية بعد 6.5 ساعات فقط، ويمكن تحضير البلازميد بعد 4 ساعات. سلالة الإشريكية القولونية 10-بيتا المؤهلة (NEB #C3019) هي مشتق من DH10B™، ويمكن استخدامها لتحويل البلازميدات الكبيرة وBACs. سلالة الإشريكية القولونية Dam-/dcm- المؤهلة (NEB يمكن استخدام سلالة (#C2925) لنمو البلازميد الخالي من المثيلة. إذا تأثرت كفاءة الاستنساخ سلبًا بعناصر الحمض النووي المتكررة في الناقل أو تسلسل الإدخال، يُوصى باستخدام سلالة NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). (راجع بروتوكول استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على عناصر متكررة). هل أنت محتار بشأن سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك عينة NEB Cloning Competent E.coli Sampler (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. س: لماذا كانت المستعمرات بأحجام مختلفة بعد تحويل سلالة E.coli المؤهلة dam-/dcm- (C2925)؟ ج: سلالة Dam-/dcm- (NEB #C2925H/C2925I) هي سلالة متحولة من E. coli، وتؤثر طفرة dam على هذه السلالة بعدة طرق، بما في ذلك انخفاض كفاءة التحويل، وانخفاض معدل النمو، وارتفاع معدل الطفرات. من الطبيعي الحصول على مستعمرات بأحجام مختلفة في سلالات NEB. #C2925H/C2925I. لوحظ هذا أثناء تحويل البلازميد pUC19. تم اختبار المستعمرات من كلا الحجمين، واحتوت جميعها على البلازميد pUC19. تم اختيار مستعمرة كبيرة واحدة وتقليبها في وسط SOB ثم زرعها على وسط LB/Amp. مرة أخرى، ظهرت المستعمرات الكبيرة والصغيرة في صباح اليوم التالي. س: كيف يمكنني حساب كفاءة التحويل (C2925)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (cfu) التي يمكن إنتاجها عن طريق تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم معين من الخلايا المؤهلة. هذا المصطلح مُضلل نوعًا ما، حيث نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلًا من ذلك، يتم حساب الكفاءة بشكل روتيني عن طريق تحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك العديد من المتغيرات التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = عدد المستعمرات / ميكروغرام / التخفيف عدد المستعمرات = عدد المستعمرات المحسوبة على الطبق. ميكروغرام = كمية الحمض النووي المُحوَّل مُعبَّر عنها بالميكروغرام. التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع. مثال على حساب كفاءة التحويل: تحويل 2 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من الحمض النووي pUC19 المُتحكَّم به إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، ثم زيادة حجمها بإضافة 950 ميكرولتر من وسط SOC قبل زرع 100 ميكرولتر. إذا تم عدّ 20 مستعمرة على الطبق، فإن كفاءة التحويل هي: عدد المستعمرات = 20 ميكروغرام، الحمض النووي = 0.0001، التخفيف = 100/1000 = 0.1، كفاءة التحويل = 20/0.0001/0.1 = 2 × 10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام. س: هل يُمكنني تخزين الخلايا المُؤهَّلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المُؤهَّلة عند -80 درجة مئوية. التخزين عند -20 درجة مئوية سيؤدي إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. (TE). عند اختبارها على خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. وفقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج ربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2925H وNEB #C2925I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix and Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كليهما ينتج أعدادًا مماثلة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: كيف يجب تخزين SOC وسط النمو؟ توصي نشرة معلومات المنتج (SOC) التي استلمتها مع خلاياي المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط النمو (SOC) إما في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه فقط في درجة حرارة الغرفة وإلا ستتكون بلورات. س: كيف يتم تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنظيف القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا كان الحمض النووي البلازميدي يُستخدم كقالب أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، ويمكن إزالته بمعالجة DpnI عند الضرورة. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل. إذا تعذر ذلك، يُنصح بتنقية الجل. قد يُدخل استخلاص الجل ثيوسيانات الغوانيدين (من محلول الإذابة) مما قد يُقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الجل بحيث يُمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يُمكن إجراء هضم البلازميد بواسطة إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام عمود الفصل. يُمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع.