نيو إنجلاند بيولابس، C2984I، NEB® Turbo Competent E. coli (عالية الكفاءة)

خلايا تتميز بنمو سريع للمستعمرات (6.5 ساعات) الفئات ذات الصلة استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة التطبيقات حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، التحويل، الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام الكواشف من NEB المواصفات مضاد حيوي لاختيار البلازميد مضادات حيوية لاختيار البلازميد تركيز العمل أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل كاناميسين 30 ميكروغرام/مل ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل ملاحظات الشحن يتم الشحن على ثلج جاف الأسئلة الشائعة س: ما هي سلالات الخلايا المؤهلة المتوافقة مع Gateway® Cloning؟ ج: يمكن استخدام سلالات E. coli المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) وNEB 10-beta (NEB #C3019) مع Gateway Cloning. س: هل يؤثر حجم البلازميد على حجم المستعمرة (C2984)؟ ج: نعم. قمنا بتحويل بلازميد pUC19 (2.7 كيلوبايت) وبلازميد آخر بحجم 10.5 كيلوبايت إلى بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Turbo (NEB #C2984H) جنبًا إلى جنب باتباع بروتوكول التحويل لمدة 5 دقائق المرفق. بعد نمو ليلي، وُجدت 92 مستعمرة على طبق واحد لتحويل pUC19، بقطر 2.06 ± 0.11 ملم. بينما وُجدت 13 مستعمرة على طبق واحد لتحويل بلازميد 10.5 كيلوبايت، بقطر 1.31 ± 0.41 ملم. لاحظ أن المستعمرات الحاملة للبلازميد الأكبر كانت أصغر حجمًا مقارنةً بالمستعمرات الحاملة لـ pUC19. س: ما هي المدة التي يمكنني خلالها تنقية البلازميد بعد التلقيح من مستعمرة واحدة باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Turbo (C2984)؟ ج: عند التلقيح من مستعمرة واحدة نُمت طوال الليل، يمكن تحضير الحمض النووي المصغر بعد 3 ساعات فقط من النمو. سيتضاعف محصول الحمض النووي بعد 4 ساعات من النمو من التلقيح (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المدة التي يجب أن أحضن فيها الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2984H وNEB #C2984I)؟ ج: يُوصى بحضن الحمض النووي مع خلايا NEB Turbo المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. عند اختبارها مع pUC19، لم يؤثر وقت الحضانة لمدة دقيقتين فقط على كفاءة التحويل (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي خصائص السلالة (C2984)؟ ج: خصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة استنساخ موصوفة أدناه. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. الفحص الأزرق/الأبيض: (F' Δ(lacZ)M15 يُنتج جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز؛ Δ(lac-proAB) يحذف جين بيتا-غالاكتوزيداز من الكروموسوم. يُشفّر البلازميد pUC19 والبلازميدات المشابهة الببتيد ألفا من بيتا-غالاكتوزيداز (lacZ). يمكن للببتيد ألفا أن يتحد مع جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز الموجود على F' (تكميل ألفا). عند إعادة تكوين بيتا-غالاكتوزيداز بهذه الطريقة، يمكنه شطر X-gal، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تُعطّل الإدخالات المستنسخة في منطقة الربط المتعددة للبلازميد جين الببتيد ألفا، فتكون المستعمرات بيضاء. إعادة التركيب بالإضافة إلى: (recA+) تمتلك الإشريكية القولونية نظام إصلاح يُعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. على الرغم من أن المستنسخات الجينومية غالبًا ما تحتوي على في المناطق المكررة، يكون طولها عادةً أقل من 200 زوج قاعدي. لا يتسبب نظام إصلاح RecA في إعادة ترتيب أو حذف في هذه الظروف. تميل السلالات التي تحتفظ بوظيفة recA سليمة إلى أن تكون أكثر صحة وتنمو بشكل أسرع من سلالات recA-. نقص الإندونوكلياز I: (endA1) تحتوي المساحة المحيطة بالبلازم في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل كبير. نقص التقييد: (Δ(hsdS-mcrB)5) تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إندونوكلياز التقييد EcoK من النوع الأول الذي يقطع الحمض النووي عند المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل متجانس، سيتم قطع الحمض النووي الغريب عند هذه المواقع. يؤدي حذف جين hsdS إلى إلغاء نشاطي الإندونوكلياز والميثيل ترانسفيراز لإنزيم EcoK. نقص جزئي في تقييد الميثيل: (Δ(hsdS-mcrB)5) تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات المشفرة بواسطة الجينات mcrA وmcrB وmrr، والتي تقوم بقطع الحمض النووي ذي أنماط الميثيل النموذجية في الخلايا حقيقية النواة. لن يتم ميثيل الحمض النووي المشتق من قطع PCR أو الحمض النووي المكمل أو الحمض النووي الذي تم استنساخه مسبقًا في بكتيريا الإشريكية القولونية في هذه المواقع، ولن يتم قطعه. تحتوي هذه السلالة على إندونوكليازات McrA وMrr وظيفية، وقد لا تكون مناسبة للاستنساخ المباشر للحمض النووي حقيقي النواة. حساسة لفيروس M13: (F´) تتطلب الإصابة بفيروس M13 وغيره من الفيروسات المماثلة خصائص سطحية في بكتيريا الإشريكية القولونية، والتي يوفرها البلازميد F الذي تحمله بعض سلالات الإشريكية القولونية. تسمح الإصابة بهذه الفيروسات بإنتاج الحمض النووي أحادي السلسلة وتوليد مكتبات عرض العاثيات. غالبًا ما يتم تعديل البلازميد F لحمل حمض نووي مفيد آخر في الخلية [مثل Δ(lacZ)M15 في هذا الخط الخلوي]، وعند تعديله يُسمى F´. مقاومة العاثية T1: (fhuA2) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلية. يُكسب حذف هذا الجين مقاومة لهذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو نمو الخلية. التحكم في مُحفز اللاكتوز: (lacIq) يمنع مثبط اللاكتوز التعبير من مُحفزات lac وtac وtrc التي تحملها عادةً بلازميدات التعبير. إذا لم يكن مستوى مثبط اللاكتوز في خلايا الإشريكية القولونية كافيًا لتثبيط التعبير عبر هذه المُحفزات أثناء التحول أو نمو الخلية، فإن حتى المستويات المنخفضة من التعبير يمكن أن تُقلل من كفاءة التحول وتؤدي إلى استبعاد المُتحولات المرغوبة. تُساعد جزيئات مثبط اللاكتوز الإضافية في سلالات lacIq على تقليل نشاط المُحفز إلى الحد الأدنى حتى يتم استخدام IPTG تمت الإضافة. DH5α™ هي علامة تجارية لشركة Invitrogen Corporation. س: كيف يبدو منحنى نمو خلايا NEB Turbo مقارنةً بخلايا DH5α؟ ج: تنمو خلايا NEB Turbo بسرعة ليس فقط على الأطباق (تظهر المستعمرات بعد 6.5 ساعات)، ولكن أيضًا في الوسط السائل. في قارورة مهتزة عند 37 درجة مئوية، تصل خلايا NEB Turbo إلى كثافة بصرية OD600 تبلغ 6.0 بعد 6 ساعات من النمو. في ظل نفس الظروف، تصل خلايا DH5α إلى كثافة بصرية OD600 تبلغ 2.3. عند اختبارها في مُخَمِّر، كانت النتائج متقاربة. (انظر الشكل في صفحة منتج NEB #C2984). س: ما الفرق بين NEB #C2984H وNEB #C2984I؟ ج: إنهما نفس الخلايا بنفس الكفاءة ولكنهما متوفرتان بأشكال مختلفة. يتم تغليف C2984H مع 20 أنبوب تحويل للاستخدام مرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى عملية التحويل. أنابيب لسهولة الاستخدام. تأتي سلالة C2984I في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، كل منها يحتوي على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل عملية التحويل. يحتوي كل أنبوب على خلايا كافية لأربع عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. يُعد استخدام سلالة C2984I خيارًا اقتصاديًا عند إجراء 3 أو 4 عمليات تحويل في وقت واحد. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2984H وNEB #C2984I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لسلالة الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984H وNEB #C2984I). لا تتأثر كفاءة التحويل بشكل كبير بتغيير وقت الصدمة الحرارية ضمن النطاق المحدد. من 10 إلى 60 ثانية. توقع انخفاضًا بنسبة 20% تقريبًا في كفاءة التحويل عند التعرض لصدمة حرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: أي سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة يجب أن أستخدمها للاستنساخ العام؟ ج: بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) هي مشتق عالي الكفاءة من DH5α™، وهي سلالة الاستنساخ القياسية في هذا المجال. تسمح بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984) وبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha F´Iq (NEB #C2992) باستنساخ الجينات التي قد تكون سامة نظرًا للتحكم الدقيق في التعبير بواسطة lacIq، وهما مناسبتان للفحص الأزرق/الأبيض. توفر بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984) سرعة لا مثيل لها في عمليات التحويل، حيث تظهر المستعمرات المرئية بعد 6.5 ساعات فقط، ويمكن تحضير البلازميد بعد 4 ساعات. بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta تُعدّ بكتيريا الإشريكية القولونية (NEB #C3019) مشتقة من سلالة DH10B™، ويمكن استخدامها لتحويل البلازميدات الكبيرة وBACs. ويمكن استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المُؤهلة Dam-/dcm- (NEB #C2925) لنمو البلازميدات دون مثيلة. إذا تأثرت كفاءة الاستنساخ سلبًا بوجود عناصر DNA متكررة في الناقل أو تسلسل الإدخال، يُوصى باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المُؤهلة المستقرة من NEB (NEB #C3040). (راجع بروتوكول استنساخ DNA الذي يحتوي على عناصر متكررة). هل أنت محتار بشأن سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك عينة بكتيريا الإشريكية القولونية المُؤهلة للاستنساخ من NEB (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المُؤهلة الشائعة. س: كيف يُمكنني حساب كفاءة التحويل (C2984)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (cfu) التي يُمكن إنتاجها بتحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم مُحدد من الخلايا المُؤهلة. يُعدّ هذا المصطلح مُضللاً بعض الشيء، إذ نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلاً من ذلك، تُحسب الكفاءة بشكل روتيني عن طريق تحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك المتغيرات العديدة التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = عدد المستعمرات / ميكروغرام / التخفيف. المستعمرات = عدد المستعمرات المحسوبة على الطبق. ميكروغرام = كمية الحمض النووي المُحوّل مُعبرًا عنها بالميكروغرام. التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع. مثال على حساب TE: حوّل 2 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من الحمض النووي pUC19 المُتحكم به إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، ثم قم بتنمية الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر من وسط SOC، وخفف 10 ميكرولتر إلى 1 مل في وسط SOC قبل زرع 30 ميكرولتر. إذا قمت بعدّ 150 مستعمرة على في الطبق، يكون تركيز المستعمرات (TE) كما يلي: عدد المستعمرات = 150 ميكروغرام، تركيز الحمض النووي (DNA) = 0.0001، التخفيف = 10/300 × 30/1000 = 0.001، تركيز المستعمرات = 150/0.0001/0.001 = 1.5 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام. س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2984)؟ ج: وسط SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. وسط SOC: وسط SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. وسط LB أجار: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار أزرق/أبيض. الفحص: X-gal 80 ميكروغرام/مل IPTG* 0.3 ملي مولار. *يُحذف IPTG للجينات التي قد تكون سامة: س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل (TE). عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع واحد من التخزين عند -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي يُوصى باستخدام (البلازميد أو ناتج الربط) مع 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2984H وNEB #C2984I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix and Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix and Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. لدى NEB اختبرنا خلايانا المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: كيف يجب تخزين وسط نمو SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع خلاياي المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC إما في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المرفق مع NEB #C2987R (لوحة 384 بئرًا) يجب تخزينه فقط في درجة حرارة الغرفة وإلا ستتكون بلورات. س: كيف يجب تحضير الشظايا للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع باستخدام الطرق التالية: يمكن تنقية القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا استُخدم الحمض النووي البلازميدي كقالب أثناء تفاعل PCR، فيمكن إزالته بمعالجة DpnI عند الضرورة. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل PCR. إذا لم يكن ذلك ممكنًا، يُوصى بتنقية الجل. قد يُؤدي استخلاص الجل إلى إدخال ثيوسيانات الغوانيدين (من محلول الإذابة) مما قد يُقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، قُصّ شريحة الجل بحيث يُمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يُمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام العمود. يُمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع. س: هل NEB Turbo Competent E. coli (عالية الكفاءة) أو NEB Turbo هل يُنصح باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المُؤهلة كهربائيًا لاستنساخ الحمض النووي المتكرر أو غير المستقر؟ ج: لا تحتوي بكتيريا NEB Turbo على حذف لجين recA. لاستنساخ الحمض النووي المتكرر وغير المستقر، نوصي باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المُؤهلة مستقرة من NEB (NEB #C3040).