نيو إنجلاند بيولابس، C2987U، NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficient)

فئات ذات صلة بـ NEB 5-alpha Competent، استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة ، تطبيقات إنزيمات USER® و USER II الحرارية، USER®، الاستنساخ، حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، المواصفات ، المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، وسط LB، أطباق أجار LB +/- مضاد حيوي، X-gal (اختياري)، IPTG (اختياري) ، مضاد حيوي لاختيار البلازميد، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن: يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة : س: ما هي سلالات الخلايا المؤهلة المتوافقة مع استنساخ Gateway®؟ ج: يمكن استخدام سلالتي الإشريكية القولونية المؤهلتين NEB 5-alpha (NEB #C2987) وNEB 10-beta (NEB #C3019) مع تقنية Gateway Cloning. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على سلالة الإشريكية القولونية المؤهلتين NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وفقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: كيف يمكنني زيادة كفاءة التحويل؟ أ: ثبت أن إضافة بيتا-ميركابتوإيثانول (β-ME) بتركيز نهائي 24 ملي مولار تزيد من كفاءة تحويل NEB 5-alpha بنسبة 40%. قد يختلف تأثير ذلك على كفاءة التحويل عند استخدام بلازميدات أخرى غير pUC19. تأكد من استخدام β-ME عالي النقاء ومعقم بتركيز أساسي 1.5 مولار. اتبع الإجراء التالي: بالنسبة لـ C2987H: قم بإذابة أنبوب يحتوي على خلايا E. coli المؤهلة لـ NEB 5-alpha على الجليد لمدة 10 دقائق. بالنسبة لـ C2987I: قم بإذابة أنبوب يحتوي على خلايا E. coli المؤهلة لـ NEB 5-alpha على الجليد حتى تختفي آخر بلورات الثلج. امزج برفق، ثم انقل 50 ميكرولتر من الخلايا بعناية باستخدام ماصة إلى أنبوب التحويل الموضوع على الجليد. أضف 0.8 ميكرولتر من β-ME بتركيز 1.5 مولار إلى 50 ميكرولتر من الخلايا. رجّ الأنبوب برفق 4-5 مرات لخلط الخلايا مع β-ME. لا تستخدم جهاز الخلط الدوامي. حضّن المزيج على الثلج لمدة 10 دقائق. أضف 1-5 ميكرولتر يحتوي على 1 بيكوغرام - 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميدي إلى مزيج الخلايا. رجّ الأنبوب برفق 4-5 مرات لخلط الخلايا والحمض النووي. لا تستخدم جهاز الخلط الدوامي. ضع المزيج على الثلج لمدة 30 دقيقة. لا تخلط. عرّض المزيج لصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بالضبط. لا تخلط. ضع المزيج على الثلج لمدة 5 دقائق. لا تخلط. أضف 950 ميكرولتر من محلول SOC بدرجة حرارة الغرفة إلى المزيج. ضع المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. رجّ الأنبوب بقوة (250 دورة في الدقيقة) أو قم بتدويره. سخّن أطباق الاختيار إلى 37 درجة مئوية. اخلط الخلايا جيدًا عن طريق رجّ الأنبوب وقلبه، ثم قم بإجراء عدة تخفيفات متسلسلة بمقدار 10 أضعاف في محلول SOC. انشر 50-100 ميكرولتر من كل تخفيف على طبق اختياري، ثم حضّنه طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. أو يمكنك حضّنه عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة. س: ما هي المدة اللازمة لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2987H وNEB #C2987I)؟ ج: يُنصح بحضانة الحمض النووي مع خلايا NEB 5-alpha المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. توقع انخفاضًا بنسبة 20% تقريبًا في كفاءة التحويل عند الحضانة لمدة 10 دقائق (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: كيف أحسب كفاءة التحويل (C2987)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (cfu) التي يمكن إنتاجها بتحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم معين من الخلايا المؤهلة. هذا المصطلح مُضلل نوعًا ما، إذ نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلاً من ذلك، تُحسب الكفاءة عادةً بتحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك المتغيرات العديدة التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = عدد المستعمرات / ميكروغرام / التخفيف. المستعمرات = عدد المستعمرات المحسوبة على الطبق. ميكروغرام = كمية الحمض النووي المحول معبرًا عنها بالميكروغرام. التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع. مثال على حساب TE: حوّل 2 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من الحمض النووي pUC19 كعنصر تحكم إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، ثم قم بتنمية الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر من وسط SOC، وخفف 10 ميكرولتر إلى 1 مل في وسط SOC قبل زرع 30 ميكرولتر. إذا قمت بحساب 150 مستعمرة على الطبق، فإن TE هو: عدد المستعمرات = 150 ميكروغرام، الحمض النووي = 0.0001، التخفيف = 10/300 × 30/1000 = 0.001، TE = 150/0.0001/0.001 = 1.5 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام. س: ما هي المحاليل/الوصفات (C2987)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون) 0.5% مستخلص خميرة 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز LB أجار: 1% تريبتون 0.5% مستخلص خميرة 0.17 مولار كلوريد الصوديوم 1.5% أجار فحص أزرق/أبيض: X-gal 80 ميكروغرام/مل IPTG* 0.3 ملي مولار * يُحذف IPTG للجينات التي قد تكون سامة س: ما هي خصائص السلالة (C2987)؟ ج: خصائص هذه السلالة التي تُساهم في فائدتها كسلالة استنساخ موصوفة أدناه. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. فحص أزرق/أبيض (Φ80 Δ(lacZ)M15): يُشفّر جزء أوميغا من β-gal؛ يحذف lacX74 جين β-gal على الكروموسوم. يشفر البلازميد pUC19 وغيره من نواقل الاستنساخ الببتيد α لإنزيم β-galactosidase (lacZ). يمكن للببتيد α المُعبَّر عنه من البلازميد أن يتحد مع جزء أوميغا من إنزيم β-galactosidase، الذي تُعبِّر عنه الخلية المضيفة. عند إعادة تكوين إنزيم β-galactosidase بهذه الطريقة، فإنه يستطيع شطر X-gal، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تؤدي الإدخالات المستنسخة في منطقة الربط المتعددة للبلازميد إلى تعطيل جين الببتيد α، فتكون المستعمرات بيضاء. نقص إعادة التركيب: (recA1) تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظام إصلاح يُعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. غالبًا ما تحتوي المستنسخات الجينومية على مناطق مُكرَّرة، وقد تُشكِّل عمليات إعادة الترتيب التي يتوسطها RecA مشكلة، خاصةً عندما يزيد طول مناطق التماثل عن 50 زوجًا قاعديًا. تميل السلالات التي حُذفت منها وظيفة RecA إلى النمو ببطء أكبر من سلالات recA+. نقص الإندونوكلياز I: (endA1) يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضّرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص في التقييد: (hsdR17) تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إنزيمًا داخليًا مقيدًا يقطع الحمض النووي في المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). على الرغم من أن الحمض النووي للإشريكية القولونية محمي من التحلل بواسطة ناقل ميثيل خاص به، إلا أن الحمض النووي الغريب سيُقطع في هذه المواقع. طفرة hsdR تقضي على نشاط هذا الإنزيم الداخلي. مع ذلك، تمتلك هذه السلالة أنظمة تقييد ميثيل فعالة، وقد لا تكون مناسبة للاستنساخ المباشر للحمض النووي حقيقي النواة. مقاومة لفيروس T1: (fhuA2) يتطلب فيروس T1، وهو فيروس شديد الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لإحداث العدوى. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من الفيروسات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. DH5α™ هي علامة تجارية لشركة Invitrogen. س: ما الفرق بين NEB ما الفرق بين NEB #C2987H وNEB #C2987I؟ ج: هما نفس الخلايا بنفس الكفاءة، لكنهما متوفران بأشكال مختلفة. تأتي C2987H في عبوة تحتوي على 20 أنبوب تحويل للاستخدام لمرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. أما C2987I فتأتي في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على خلايا كافية لأربع عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. إذا كنت ستجري 3 أو 4 عمليات تحويل في المرة الواحدة، فإن استخدام C2987I يُعدّ خيارًا اقتصاديًا. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما الفرق بين NEB #C2988J وNEB #C2987H؟ ج: إنها نفس خلايا NEB 5-alpha، ولكنها متوفرة بكفاءة تحويل مختلفة وبأشكال مختلفة. C2987H هي خلايا E. coli مؤهلة من NEB 5-alpha بكفاءة عالية تتراوح بين 1 و3 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من حمض pUC19 النووي. أما C2988J فهي خلايا E. coli مؤهلة من NEB 5-alpha بكفاءة استنساخ فرعي تزيد عن 1 × 10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من حمض pUC19 النووي. تُعبأ C2987H في 20 أنبوب تحويل للاستخدام الفردي، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. تُعبأ C2988J في 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 400 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد، ثم سحب 50 ميكرولتر من الخلايا باستخدام ماصة ووضعها في أنابيب التحويل الخاصة بك قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على خلايا كافية لثماني عمليات تحويل، مما يقلل من الحاجة إلى استخدام المزيد من الخلايا. تكلفة كل عملية تحويل. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2987H وNEB #C2987I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H وNEB #C2987I). توقع خسارة حوالي 60% في كفاءة التحويل عند التعرض للصدمة الحرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام تجميع جيبسون؟ ج: تركيبات الحمض النووي الناتجة متوافقة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كانت المنتجات المُجمعة أكبر من 10 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام NEB بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة 10-بيتا (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة كهربائيًا 10-بيتا (NEB #C3020). في حال احتواء الجينات المُجمَّعة على تسلسلات متكررة، يُنصح باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة المستقرة (NEB #C3040). س: أي سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة يجب استخدامها للاستنساخ العام؟ ج: بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة 5-ألفا (NEB #C2987) هي مشتق عالي الكفاءة من DH5α™، وهي سلالة الاستنساخ القياسية في هذا المجال. تسمح بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة توربو (NEB #C2984) وبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة 5-ألفا F´Iq (NEB #C2992) باستنساخ الجينات التي قد تكون سامة نظرًا للتحكم الدقيق في التعبير بواسطة lacIq، وهما مناسبتان للفحص الأزرق/الأبيض. تُضفي بكتيريا الإشريكية القولونية (NEB #C2984) سرعةً لا تُضاهى على عمليات التحويل، حيث تظهر المستعمرات بوضوح بعد 6.5 ساعات فقط، وتُصبح جاهزةً لتحضير البلازميدات بعد 4 ساعات. تُعدّ بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) مشتقةً من DH10B™، ويمكن استخدامها لتحويل البلازميدات الكبيرة وBACs. يُمكن استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية Dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925) لنمو البلازميدات دون مثيلة. إذا تأثرت كفاءة الاستنساخ سلبًا بوجود عناصر DNA متكررة في الناقل أو تسلسل الإدخال، يُوصى باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). (راجع بروتوكول استنساخ DNA الذي يحتوي على عناصر متكررة). هل أنت مُتردد في اختيار سلالة الاستنساخ المناسبة؟ يُتيح لك جهاز NEB Cloning Competent E.coli Sampler (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المُؤهلة الشائعة. س: أي نوع س: هل يجب استخدام أنابيب التحويل؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان فعالاً تماماً. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix & Go". بروتوكول يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت شركة NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2987H وNEB #C2987I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو عام واحد من تاريخ الاختبار المرفق مع المنتج. س: كيف تقارن كفاءة التحويل في تنسيق لوحة 96 بئرًا (NEB #C2987P) مع التنسيقات الأخرى؟ ج: كفاءة التحويل (TE) لتنسيق لوحة 96 بئرًا NEB 5-alpha Competent E.coli (NEB #C2987P) عالية مثل التنسيقين الآخرين، NEB #C2987H وNEB #C2987I. باستخدام 1-3 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من حمض نووي pUC19، تكون كفاءة التحويل أعلى بعشر مرات من كفاءة التحويل لأي خلايا مؤهلة أخرى متوفرة تجاريًا بتنسيق لوحة 96 بئرًا. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha بتنسيق لوحة 96 بئرًا (NEB #C2987P)؟ ج: كل من درجة الحرارة وتوقيت خطوة الصدمة الحرارية مهمان ويختلفان باختلاف حجم التحويل والوعاء. باستخدام لوحة 96 بئرًا المرفقة، فإن 10 ثوانٍ عند 42 درجة مئوية هي المدة المثلى. توقع خسارة حوالي 40% في كفاءة التحويل عند التعرض لصدمة حرارية لمدة 30 ثانية. س: أشارك في مسابقة iGEM. هل لديكم أي منتجات من NEB تنصحونني بالنظر فيها؟ ج: تقدم NEB مزيج تجميع الحمض النووي NEBuilder® HiFi (NEB #E2621) ومزيج Golden Gate Master Mixes (NEB #E1601 وNEB #E1602)، والتي تسمح بالتجميع الناجح لـ توفر NEB العديد من شظايا الحمض النووي، بغض النظر عن طولها. بالإضافة إلى ذلك، تقدم NEB سلالم الحمض النووي، وبوليميرازات عالية الدقة، وخلايا مؤهلة. على مر السنين، دعمت NEB العديد من فرق iGEM بتبرعات من المواد والإرشادات العلمية. أنشأت NEB هذه الصفحة لمساعدتك في العثور بسهولة على نماذج الطلبات، ومعلومات عن منتجات NEB، وموارد تقنية مفيدة (بما في ذلك النصائح، وأدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ومقاطع فيديو تعليمية). س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987R) في لوحة 384 بئرًا؟ ج: كل من درجة الحرارة وتوقيت خطوة الصدمة الحرارية مهمان ويعتمدان على حجم التحويل والوعاء. باستخدام لوحة 384 بئرًا المرفقة، فإن 15 ثانية عند 42 درجة مئوية هي المدة المثلى. توقع خسارة حوالي 40% في كفاءة التحويل عند إجراء صدمة حرارية لمدة 20 ثانية. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987U) في أنبوب 96؟ ج: تُعدّ كلٌّ من درجة الحرارة وتوقيت خطوة الصدمة الحرارية مهمةً وتعتمد على حجم التحويل والوعاء. باستخدام الأنبوب ذي 96 خانة المرفق، يُعدّ 30 ثانية عند 42 درجة مئوية هو الوقت الأمثل. توقع انخفاضًا بنسبة 15% تقريبًا في كفاءة التحويل عند تطبيق صدمة حرارية لمدة 20 ثانية. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تتوافق تركيبات الحمض النووي الناتجة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي NEB باستخدام خلايا NEB 5-alpha المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كانت المنتجات المُجمّعة أكبر من 15 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام خلايا NEB 10-beta المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو خلايا NEB 10-beta المؤهلة كهربائيًا من الإشريكية القولونية (NEB #C3020). إذا كانت الجينات المُجمّعة تحتوي على تسلسلات متكررة، فإن خلايا NEB Stable المؤهلة من الإشريكية القولونية... يُنصح باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية (NEB #C3040). هل أنت محتار بشأن سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك عينة بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة للاستنساخ من NEB (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 سلالات شائعة لدينا ذات كفاءة كيميائية. س: كيف يُنصح بتخزين وسط نمو SOC؟ يُوصي وسط SOC الذي استلمته مع خلاياي المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائه كمنتج مستقل، يُوصى بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المُرفق مع NEB #C2987R (لوحة واحدة بتنسيق 384 بئرًا) يجب تخزينه فقط في درجة حرارة الغرفة وإلا ستتكون بلورات. س: كيف تُحضّر الشظايا لـ هل يمكن تجميع القطع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنقية القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا استُخدم الحمض النووي البلازميدي كقالب أثناء تفاعل PCR، فيمكن إزالته بمعالجة DpnI عند الضرورة. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل PCR. إذا لم يكن ذلك ممكنًا، يُوصى بتنقية الجل. قد يُدخل استخلاص الجل ثيوسيانات الغوانيدين (من محلول الإذابة) مما قد يُقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، قُصّ شريحة الجل بحيث يُمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يمكن إجراء هضم البلازميد بواسطة إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام العمود. يمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع.