نيو إنجلاند بيولابس، C2988J، NEB® 5-alpha Competent E. coli (كفاءة الاستنساخ الفرعي)

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة: استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة، التطبيقات ، التحويل، المواصفات، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد ، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، التركيز المستخدم: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام وسط LB بدلاً من وسط SOC في خطوة النمو الخارجي (C2988)؟ ج: وسط NEB SOC للنمو الخارجي مصنوع من ببتون خالٍ من المنتجات الحيوانية، ويوفر كفاءة تحويل أعلى من وسط LB. تحتوي جميع خلايا NEB المؤهلة (باستثناء خلايا NEB 5-alpha المؤهلة للاستنساخ الفرعي [NEB#C2988J]، وخلايا NEB 10-beta المؤهلة للاستنساخ الفرعي [NEB#C3019] و[NEB#C3020K]، وخلايا NEB Stable المؤهلة للاستنساخ الفرعي [NEB#C3040]) على وسط نمو SOC ضمن مجموعاتها. كما يمكن شراء وسط نمو SOC بشكل منفصل (NEB #B9020S). س: هل يمكن استخدام خلايا NEB 5-alpha المؤهلة للاستنساخ الفرعي (NEB #C2988J) لاستنساخ أجزاء كبيرة؟ ج: تبلغ كفاءة التحويل لـ C2988J أكثر من 1 × 10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من pUC19، أي أقل بألف مرة من كفاءة التحويل لخلايا NEB المؤهلة الأخرى عالية الكفاءة (1 × 10⁹). إذا تم تحويل 50 ميكرولتر من خلايا C2988J المؤهلة باستخدام 100 بيكوغرام من pUC19 (2 ميكرولتر من حمض نووي تحكم pUC19 بتركيز 50 بيكوغرام/ميكرولتر [متوفر في خلايا NEB المؤهلة عالية الكفاءة])، فيجب إضافة 950 ميكرولتر من وسط LB لنمو الخلايا (يوفر وسط LB كفاءة تحويل بنسبة 28% فقط مقارنةً بالوسط القياسي لهذه السلالة). إذا تم نشر 100 ميكرولتر على طبق بتري، فلن يظهر سوى 2-3 مستعمرات بعد نموها طوال الليل. نوصي باستخدام خلايا مؤهلة ذات كفاءة عالية في الاستنساخ الفرعي (NEB #C2988J) فقط لتحويل البلازميد أو الاستنساخ الفرعي الروتيني، مثل إدخال قطعة بطول 1 كيلوبايت في ناقل بطول 2 كيلوبايت. تم بنجاح استنساخ قطعة بطول 0.8 كيلوبايت في pUC19 (2.7 كيلوبايت) بكفاءة تحويل بلغت 4.2 × 10⁴ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من ناقل pUC19. س: ما الفرق بين NEB #C2988J وNEB #C2987H؟ ج: هما نفس خلايا NEB 5-alpha، لكنهما متوفرتان بكفاءة تحويل مختلفة وبأشكال مختلفة. C2987H هي خلايا E. coli مؤهلة من NEB 5-alpha بكفاءة عالية تتراوح بين 1 و3 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من حمض pUC19 النووي. أما C2988J فهي خلايا E. coli مؤهلة من NEB 5-alpha بكفاءة استنساخ فرعي تزيد عن 1 × 10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من حمض pUC19 النووي. تأتي C2987H في عبوة تحتوي على 20 أنبوب تحويل للاستخدام الفردي، كل منها يحتوي على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. أما C2988J فتأتي في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، كل منها يحتوي على 400 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد، ثم سحب 50 ميكرولتر من الخلايا باستخدام ماصة ووضعها في أنابيب التحويل الخاصة بك قبل عملية التحويل. يحتوي كل أنبوب على عدد كافٍ من الخلايا لإجراء 8 عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها، لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C2988J)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لسلالة الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (كفاءة الاستنساخ الفرعي) (NEB #C2988J). توقع انخفاضًا بنسبة 40% تقريبًا في كفاءة التحويل عند التعرض للصدمة الحرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المدة التي يجب أن أحضن فيها الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C2988J)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع خلايا NEB 5-alpha المؤهلة (كفاءة الاستنساخ الفرعي) على الجليد لمدة 30 دقيقة. توقع انخفاضًا بنسبة 30% تقريبًا في كفاءة التحويل عند الحضانة لمدة 10 دقائق (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: كيف يُمكنني حساب كفاءة تحويل بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (كفاءة الاستنساخ الفرعي)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (cfu) التي يُمكن إنتاجها بتحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم مُحدد من الخلايا المؤهلة. هذا المصطلح مُضلل نوعًا ما، حيث نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلًا من ذلك، يتم حساب الكفاءة بشكل روتيني عن طريق تحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تُخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك العديد من المتغيرات التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = عدد المستعمرات / ميكروغرام / التخفيف. المستعمرات = عدد المستعمرات التي تم عدها على الطبق. ميكروغرام = كمية الحمض النووي المحول معبر عنها بالميكروغرام. التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع. مثال على حساب كفاءة التحويل: تحويل 1 ميكرولتر (1 ميكروغرام) من حمض نووي pUC19 بتركيز 1 ملغ/مل إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، ثم زيادة حجمها بإضافة 950 ميكرولتر من وسط SOC وتخفيف 10 ميكرولتر إلى 1 مل في وسط SOC قبل زرع 100 ميكرولتر. إذا قمت بحساب 250 مستعمرة على الطبق، فإن كفاءة النقل (TE) هي: عدد المستعمرات = 250 ميكروغرام من الحمض النووي = 1.0، التخفيف = 10/1000 × 100/1000 = 0.001، كفاءة النقل = 250/1/0.001 = 2.5 × 10⁵ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام. س: ما هي المحاليل/الوصفات التي أحتاجها لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha Competent (كفاءة الاستنساخ الفرعي)؟ ج: وسط SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. وسط SOC: وسط SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. وسط LB أجار: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار أزرق/أبيض. الفحص: X-gal 80 ميكروغرام/مل IPTG* 0.3 ملي مولار. *يُحذف IPTG للجينات التي قد تكون سامة. س: ما هي خصائص سلالة NEB 5-alpha Competent E. coli (كفاءة الاستنساخ الفرعي)؟ ج: الخصائص التي تُسهم في فائدة هذه السلالة كسلالة استنساخ موضحة أدناه. الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص تظهر بين قوسين. الفحص الأزرق/الأبيض: يُنتج البلازميد (Φ80 Δ(lacZ)M15) الجزء أوميغا من بيتا-جالاكتوزيداز (β-gal)؛ بينما يحذف البلازميد (argF-lacZ) جين بيتا-جالاكتوزيداز من الكروموسوم. يشفر البلازميد pUC19 والبلازميدات المشابهة الببتيد ألفا من بيتا-جالاكتوزيداز (lacZ). يمكن للببتيد ألفا أن يتحد مع الجزء أوميغا من بيتا-جالاكتوزيداز المحمول على f80 (تكميل ألفا). عند إعادة تكوين بيتا-جالاكتوزيداز بهذه الطريقة، يمكنه شطر 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-بيتا-دي-جالاكتوزيداز (X-gal)، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تؤدي الإدخالات المستنسخة في منطقة الربط المتعددة للبلازميد إلى تعطيل جين الببتيد ألفا، فتكون المستعمرات بيضاء. نقص إعادة التركيب: (recA1) تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظام إصلاح يُعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. غالبًا ما تحتوي النسخ الجينية على مناطق مُكررة، وقد تُسبب عمليات إعادة الترتيب التي يُحفزها بروتين RecA مشاكل، خاصةً عندما يزيد طول مناطق التماثل عن 50 زوجًا قاعديًا. تميل السلالات التي حُذفت منها وظيفة RecA إلى النمو ببطء أكثر من سلالات recA+. نقص الإندونوكلياز I: (endA1) يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير مُحدد. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تُؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، مما يُحسّن جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد: (hsdR17) تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إندونوكلياز تقييد يقوم بقطع الحمض النووي الذي يحتوي على مواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل مُناسب، فإن الحمض النووي الأجنبي سيتم قطع الحمض النووي في هذه المواقع. تعمل طفرة hsdR على إلغاء نشاط هذا الإندونوكلياز. مع ذلك، يمتلك هذا السلالة أنظمة تقييد ميثيل فعالة، وقد لا يكون مناسبًا للاستنساخ المباشر للحمض النووي حقيقي النواة. مقاومة العاثية T1: (fhuA2) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. DH5α™ هي علامة تجارية لشركة Invitrogen. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلًا من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحول. عند اختبارها على الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحول بعد 24 ساعة فقط. التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع الأنبوب سعة 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل الذي اختبرناه كان فعالاً. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج ربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C2988J)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix and Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل خلاياك ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كليهما ينتج أعدادًا مماثلة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: كيف يتم تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنظيف القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كان ناتج التضخيم تزيد نقاوة الحمض النووي البلازميدي عن 95%. في حال استخدام الحمض النووي البلازميدي كقالب أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يمكن إزالته باستخدام إنزيم DpnI عند الضرورة. إذا لوحظ ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل. في حال تعذر ذلك، يُنصح بتنقية الهلام. قد يؤدي استخلاص الهلام إلى إدخال ثيوسيانات الغوانيدين (من محلول الإذابة) مما قد يقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الهلام بحيث يمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الهلام. يمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام عمود الفصل. يمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع.