نيو إنجلاند بيولابس، C3013I، T7 Express lysY/Iq Competent E. coli (High Efficiency)

كفاءة كيميائية عالية. الفئات ذات الصلة : التعبير عن T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، التطبيقات: التعبير عن T7، التعبير عن البروتين السام، التعبير عن البروتين الغشائي، المواصفات: مضاد حيوي لاختيار البلازميد، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة: س: لماذا لا توجد مستعمرات أو لا يوجد نمو في المزرعة السائلة (C3013)؟ ج: على الرغم من أن التعبير عن T7 منظم بإحكام، فقد يكون هناك مستوى منخفض من التعبير القاعدي في مضيف T7 Express. إذا كان من المحتمل حدوث سمية للبروتين المُعبَّر عنه، فينبغي إجراء تحويل بلازميد التعبير في أحد السلالات التالية: » T7 Express Iq: يؤدي الإفراط في التعبير عن مثبط LacI إلى تقليل التعبير القاعدي لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7. » T7 Express lysY: ينتج lysY إنزيم الليزوزيم T7 الطافر الذي يرتبط ببوليميراز الحمض النووي الريبي T7، مما يقلل من التعبير القاعدي للبروتين المستهدف. عند التحفيز، يقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 المُصنَّع حديثًا بمعايرة الليزوزيم، مما يؤدي إلى التعبير عن البروتين المستهدف. » يجمع T7 Express Iq/lysY بين التأثيرين السابقين. قد يُخفف الحضانة عند 30 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة من مشاكل السمية. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من تركيز المضاد الحيوي (اختبره باستخدام بلازميد تحكم). س: لماذا لا يظهر أي بروتين على الهلام أو لا يوجد نشاط (C3013)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا قد تخلصت من عناصر في بلازميد التعبير أو حذفتها. قم بزراعة الخلايا لتحفيز إنتاج البروتين. قبل التحفيز مباشرةً، ازرع عينة على طبقين متطابقين، أحدهما يحتوي على مضاد حيوي والآخر لا يحتوي عليه. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق ملحوظ في عدد المستعمرات على الطبقين. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق التي تحتوي على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنةً بالأطباق الخالية منه. س: لماذا يكون البروتين المُحفَّز غير قابل للذوبان (C3013)؟ ج: تحقق من عدم الذوبان - هذا مهم لأن التعبير عن T7 غالبًا ما يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة جدًا من البروتين، مما قد يجعل البروتين المستهدف غير قابل للذوبان. الحلول المتاحة هي: » التحفيز في درجات حرارة منخفضة (حتى 12-15 درجة مئوية طوال الليل) » تقليل تركيز IPTG إلى 0.01-0.1 ملي مولار » التحفيز لفترة أقصر (حتى 15 دقيقة) » التحفيز في وقت مبكر من النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4) س: ما هي الحلول/الوصفات (C3013)؟ ج: وسط SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون)، 0.5% مستخلص خميرة، 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم. وسط SOC: وسط SOB + 20 ملي مولار جلوكوز. وسط LB أجار: 1% تريبتون، 0.5% مستخلص خميرة، 0.17 مولار كلوريد الصوديوم، 1.5% أجار. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. التخزين عند -20 درجة مئوية سيؤدي إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءتها بعد يومين، و99.6% منها بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما الفرق بين NEB #C3013H وNEB #C3013I؟ ج: هما نفس الخلايا بنفس الكفاءة، لكنهما متوفرتان بأشكال مختلفة. تأتي C3013H في عبوة تحتوي على 20 أنبوب تحويل للاستخدام لمرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. أما C3013I فتأتي في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على عدد كافٍ من الخلايا لإجراء 4 عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. إذا كنت تجري 3 أو 4 عمليات تحويل في المرة الواحدة، فإن استخدام C3013I يُعدّ خيارًا اقتصاديًا. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها، لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هي خصائص السلالة (C3013)؟ ج: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتين. تظهر الأنماط الجينية المسؤولة عن هذه الخصائص بين قوسين. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (lacZ::T7 gene1): تحتوي سلالة T7-Express على جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 مُدرجًا في أوبيرون اللاكتوز على كروموسوم الإشريكية القولونية، ويتم التعبير عنه تحت سيطرة مُحفز اللاكتوز. يوفر هذا التكوين تحفيزًا مُتحكمًا به لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7، وبالتالي، تحكمًا قابلًا للتحفيز في نسخ الجينات الواقعة أسفل مُحفز T7. يوفر هذا النظام مزايا محتملة مقارنةً بسلالات مثل BL21(DE3)، التي تحمل بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على طليعة عاثية مُتَحَوِّلة. على الرغم من أن λDE3 يكون عادةً خاملاً في كروموسوم العائل، إلا أن تحفيز سلسلة SOS قد يحدث نتيجةً لتعبير بروتينات تُلحق الضرر بكروموسوم الإشريكية القولونية، سواءً بشكل مباشر أو غير مباشر. قد يؤدي ذلك إلى تحلل الخلية. التحكم في مُحفِّز اللاكتوز (lacIq): يمنع مثبط اللاكتوز التعبير من مُحفِّزات lac وtac وtrc التي تحملها عادةً بلازميدات التعبير. إذا لم يكن مستوى مثبط اللاكتوز في خلايا الإشريكية القولونية كافيًا لتثبيط التعبير عبر هذه المُحفِّزات أثناء التحول أو نمو الخلية، فإن حتى المستويات المنخفضة من التعبير عن الجينات السامة يمكن أن تُقلل من كفاءة التحول وتستبعد المُحوَّلات المرغوبة. تُساعد جزيئات مثبط اللاكتوز الإضافية في سلالات lacIq على تقليل نشاط المُحفِّز إلى الحد الأدنى حتى إضافة IPTG. الليزوزيم T7 (lysY): تُعبِّر هذه السلالة عن مُتغير الليزوزيم T7 K128Y الذي يفتقر إلى نشاط الأميداز، ولكنه يحتفظ بالقدرة على تثبيط بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. يتم تقليل التعبير القاعدي للجين المستهدف دون تثبيط التعبير المحفز بواسطة IPTG. يحمل جين lysY على بلازميد miniF أحادي النسخة. نقص البروتياز ([lon] ompT): تفتقر سلالات الإشريكية القولونية B بشكل طبيعي إلى بروتياز lon، الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد بروتياز OmpT على سطح الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالتي K-12 وB، ويُفترض أنه يساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. الخلايا التي تفتقر إلى كلا البروتيازين أكثر استجابة لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. التعافي من تلف الحمض النووي (sulA11): تستطيع خلايا الإشريكية القولونية تحمل قدر كبير من تلف الحمض النووي المزمن طالما سُمح للإصلاح بالاستمرار. تتأثر هذه القدرة سلبًا إذا لم تتمكن الخلايا من الانقسام بعد الإصلاح. في خلايا lon-، يتراكم بروتين SulA، وهو مثبط لانقسام الخلايا، مما يجعل الخلايا شديدة الحساسية لتلف الحمض النووي. تسمح طفرة sulA المُدخلة في سلالة T7-Express للخلايا بالانقسام بشكل طبيعي في غياب بروتياز Lon. نقص الإندونوكلياز I (endA1): يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على الإندونوكلياز غير النوعي EndA. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تحذف طفرة endA هذا الإندونوكلياز، ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد (Δ(mcrC-mrr)114::IS10): تحمل سلالات الإشريكية القولونية B من النوع البري إندونوكلياز تقييد من النوع الأول، والذي يقطع الحمض النووي عند الموقع TGA(N8)TGCT. بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل مُناسب، سيتم قطع الحمض النووي الغريب عند هذه المواقع. يؤدي الحذف الموصوف أعلاه إلى إزالة كل من الميثيلاز والإندونوكلياز. نقص تقييد الميثيل (Δ(mcrC-mrr)114::IS10 و R(mcr-73::miniTn10--TetS)2): تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات المشفرة بواسطة mcrA و mcrBC و mrr، والتي تقوم بقطع الحمض النووي ذي أنماط الميثيل الموجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. تم تعطيل جميع إنزيمات Mcr الثلاثة و Mrr في T7 Express، مما يسمح بإدخال الحمض النووي الجينومي من هذه الخلايا عند الرغبة. مقاومة العاثية T1 (fhuA2): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يمنح حذف هذا الجين مقاومة لهذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C3013H وNEB #C3013I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية T7 Express lysY/Iq المؤهلة (NEB #C3013H وNEB #C3013I). توقع انخفاضًا بنسبة 50% تقريبًا في كفاءة التحويل عند التعرض للصدمة الحرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المدة التي يجب أن أحضن فيها الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C3013H وNEB #C3013I)؟ ج: يُوصى بحضن الحمض النووي مع خلايا T7 Express lysY/Iq المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. عند اختبارها مع pUC19، لم يؤدِ وقت حضانة لمدة دقيقتين فقط إلى انخفاض ملحوظ في كفاءة التحويل (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: هل سلالة T7 Express lysY/Iq (NEB #C3013H وNEB #C3013I) متوافقة مع إجراءات التحفيز الذاتي؟ ج: سلالة T7 Express lysY/Iq غير متوافقة مع إجراءات التحفيز الذاتي. في أوساط التحفيز الذاتي، يعمل اللاكتوز على تحفيز التعبير عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 عند تحويله إلى ألو-لاكتوز بواسطة بيتا-جالاكتوزيداز (ناتج جين lacZ). لذلك، يجب إجراء التحفيز الذاتي باستخدام سلالات ذات أوبيرون لاك سليم (1). في سلالة T7 Express lysY/Iq، يُعطّل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (جين T7 1) جين lacZ، مما يؤدي إلى تعطيل بيتا-جالاكتوزيداز. لذلك، لا يُنصح باستخدام سلالة T7 Express lysY/Iq في إجراءات التحفيز الذاتي. نوصي باستخدام سلالات المضيف BL21(DE3) (NEB #C2527H وNEB #C2527I) أو NiCo21(DE3) (NEB #C2529H) لإجراءات التحفيز الذاتي. (1) Studier, FW (2005) Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures Protein Expr. Purif. 41, 207-34. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع أنبوب 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج ربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C3013H وNEB #C3013I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية سنتان من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix & Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا يتطلب الأمر خطوة صدمة حرارية. وقد اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا السلالتين تُنتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ إلا أن مستعمرات سلالة NEB تكون أكبر حجمًا عند استخدام نفس فترة الحضانة. س: هل يُعدّ الانتقاء بالمضادات الحيوية ضروريًا للحفاظ على بلازميد MiniF-lysY-lacIq؟ ج: على الرغم من أن بلازميد MiniF يحمل جين مقاومة الكلورامفينيكول، إلا أن إضافة الكلورامفينيكول ليست ضرورية. في حال إضافته، يجب أن يكون تركيز الكلورامفينيكول النهائي 10 ميكروغرام/مل. مستويات الكلورامفينيكول التي تزيد عن 15 ميكروغرام/مل ستُعيق النمو. س: هل يخضع التعبير عن T7 لكبح الكاتابوليت في سلالات NEB T7 Express أو SHuffle؟ ج: تم استنساخ جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 في أوبيرون اللاكتوز الكروموسومي. بما أن التعبير يُتحكم فيه بواسطة أوبيرون اللاكتوز الأصلي، فإن إضافة الجلوكوز ستؤدي إلى كبح الكاتابوليت. وبالتالي، سيكون التعبير الأساسي للبروتين من نواقل محفز T7 أكثر تحكمًا عند وجود الجلوكوز في الوسط. عندما يكون الجلسرين هو المصدر الأساسي للكربون، فلا ينبغي أن يكون هناك أي تأثير على أوبيرون اللاكتوز.