نيو إنجلاند بيولابس، C3019I، NEB® 10-beta Competent E. coli (High Efficiency)

فئات ذات صلة بـ NEB 10-beta Competent: استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة، تطبيقات إنزيمات USER® و USER II الحرارية، USER®، الاستنساخ، الطفرات الموجهة للموقع، تحديد المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن: يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة : س: ما هي سلالات الخلايا المؤهلة المتوافقة مع استنساخ Gateway®؟ ج: يمكن استخدام سلالتي E. coli المؤهلتين NEB 5-alpha (NEB #C2987) وNEB 10-beta (NEB #C3019) مع استنساخ Gateway. س: ما هي خصائص السلالة (C3019)؟ أ: فيما يلي وصف لخصائص هذه السلالة التي تُسهم في فائدتها كسلالة استنساخ. تظهر الأنماط الجينية المسؤولة عن هذه الخصائص بين قوسين. فحص الأزرق/الأبيض (Φ80 Δ(lacZ)M15): يُشفّر جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز؛ يحذف lacX74 جين بيتا-غالاكتوزيداز على الكروموسوم. يُشفّر pUC19 ونواقل الاستنساخ الأخرى ببتيد ألفا من بيتا-غالاكتوزيداز (lacZ). يمكن لببتيد ألفا المُعبَّر عنه من البلازميد أن يتحد مع جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز، الذي تُعبِّر عنه الخلية المضيفة. عند إعادة تكوين بيتا-غالاكتوزيداز بهذه الطريقة، يمكنه شطر X-gal، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تُعطِّل الإدخالات المُستنسخة في مُرتبط البلازميد جين ببتيد ألفا، فتكون المستعمرات بيضاء. نقص في إعادة التركيب: (recA1) تمتلك بكتيريا الإشريكية القولونية نظام إصلاح يُعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. غالبًا ما تحتوي النسخ الجينية على مناطق مُكررة، وقد تُسبب عمليات إعادة الترتيب التي يُسببها recA مشاكل، خاصةً عندما يزيد طول مناطق التماثل عن 50 زوجًا قاعديًا. تميل السلالات التي حُذفت منها وظيفة recA إلى النمو ببطء أكثر من سلالات recA+. نقص في الإندونوكلياز I: (endA1) يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير مُحدد. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، مما يُحسّن جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد [Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إنزيمًا داخليًا للتقييد يقوم بقطع الحمض النووي ذي المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل مُماثل، سيتم قطع الحمض النووي الغريب عند هذه المواقع. يؤدي الحذف المذكور أعلاه إلى إزالة كل من ناقل الميثيل والإندونوكلياز. نقص تقييد الميثيل [mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: تمتلك الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات، mcrA وmcrB وmrr، التي تقوم بقطع الحمض النووي ذي أنماط الميثيل الموجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. الحمض النووي المُستخلص من قطع PCR، cDNA أو أن الحمض النووي الذي تم استنساخه مسبقًا في بكتيريا الإشريكية القولونية لن يخضع للمثيلة في هذه المواقع ولن يتم قطعه. تم تعطيل جميع إنزيمات Mcr الثلاثة في NEB 10-beta، مما يسمح بإدخال الحمض النووي حقيقي النواة ذي الأصل الجينومي (مثل المكتبات الأولية) إذا لزم الأمر. مقاومة العاثية T1 (fhuA): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. يرجى أيضًا مشاهدة الحلقة 1 من NEB TV لمعرفة المزيد عن البيولوجيا التركيبية. س: ما الفرق بين NEB #C3019H وNEB #C3019I؟ ج: إنهما نفس الخلايا بنفس الكفاءة ولكن يتم توفيرهما بتنسيقات مختلفة. يتم تعبئة C3019H مع 20 أنبوب تحويل للاستخدام مرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. بلازميد أو يمكن إضافة ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. تأتي سلالة C3019I في عبوة تحتوي على 6 أنابيب، كل منها يحتوي على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. يحتوي كل أنبوب على خلايا كافية لأربع عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. يُعد استخدام سلالة C3019I خيارًا اقتصاديًا عند إجراء 3 أو 4 عمليات تحويل في وقت واحد. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C3019H وNEB #C3019I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ الفحص المرفق مع المنتج. س: أي سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة يجب استخدامها للاستنساخ العام؟ ج: بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) هي... مشتق عالي الكفاءة من سلالة DH5α™، وهي سلالة الاستنساخ القياسية في هذا المجال. تسمح سلالتا NEB Turbo Competent E. coli (NEB #C2984) وNEB 5-alpha F´Iq Competent E. coli (NEB #C2992) باستنساخ الجينات التي قد تكون سامة بفضل التحكم الدقيق في التعبير بواسطة lacIq، وهما مناسبتان للفحص الأزرق/الأبيض. توفر سلالة NEB Turbo Competent E. coli (NEB #C2984) سرعة فائقة في عمليات التحويل، حيث تظهر المستعمرات بوضوح بعد 6.5 ساعات فقط، ويمكن تحضير البلازميد بعد 4 ساعات. أما سلالة NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) فهي مشتقة من DH10B™، ويمكن استخدامها لتحويل البلازميدات الكبيرة وBACs. بينما يمكن استخدام سلالة Dam-/dcm- Competent E. coli (NEB #C2925) لنمو البلازميدات دون مثيلة. في حال تأثرت كفاءة الاستنساخ سلبًا في حالة وجود عناصر DNA متكررة في الناقل أو تسلسل الإدخال، يُنصح باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). (راجع بروتوكول استنساخ DNA الذي يحتوي على عناصر متكررة). هل أنت محتار بشأن سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك أداة أخذ عينات بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Cloning Competent E.coli Sampler (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. س: هل يؤثر حجم البلازميد على كفاءة التحويل (C3019)؟ ج: نعم. قمنا بتحويل سلسلة من البلازميدات التي تتراوح أحجامها من 2.7 كيلوبايت (pUC19) إلى 24 كيلوبايت إلى بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha efficient E. coli (NEB #C2987H) وNEB 10-beta efficient E. coli (NEB #C3019H) جنبًا إلى جنب. لاحظنا أن كفاءة التحويل تتأثر بحجم البلازميد. يتم تحويل خلايا NEB 10-beta الكيميائية المؤهلة بكفاءة أكبر باستخدام البلازميدات الكبيرة مقارنةً بخلايا NEB 10-beta. خلايا 5-ألفا (انظر الشكل في صفحة منتج NEB #C3019H). يُوصى باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-بيتا المؤهلة لتحويل البلازميدات الكبيرة ومنتجات التجميع الكبيرة الناتجة عن تفاعلات NEBuilder® HiFi وGibson Assembly® وGolden Gate Assembly. س: كيف يُمكنني حساب كفاءة التحويل (C3019)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (cfu) التي يُمكن إنتاجها عن طريق تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم مُحدد من الخلايا المؤهلة. هذا المصطلح مُضلل نوعًا ما، حيث نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلًا من ذلك، يتم حساب الكفاءة بشكل روتيني عن طريق تحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تُخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك العديد من المتغيرات التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = عدد المستعمرات / ميكروغرام / التخفيف، حيث عدد المستعمرات هو عدد الخلايا المؤهلة. عدد المستعمرات المحسوبة على الطبق (ميكروغرام) = كمية الحمض النووي المحول معبرًا عنها بالميكروغرام. التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع. مثال على حساب كفاءة النقل: تحويل 2 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من الحمض النووي pUC19 الضابط إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، ثم زيادة حجمها بإضافة 250 ميكرولتر من وسط NEB 10-beta/Stable Outgrowth Medium، وتخفيف 10 ميكرولتر إلى 1 مل في وسط NEB 10-beta/Stable Outgrowth Medium قبل زرع 30 ميكرولتر. إذا تم عدّ 150 مستعمرة على الطبق، فإن كفاءة النقل هي: عدد المستعمرات = 150 ميكروغرام، الحمض النووي = 0.0001، التخفيف = 10/300 × 30/1000 = 0.001، كفاءة النقل = 150/0.0001/0.001 = 1.5 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام. س: هل يمكن هل أقوم بتخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. فقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع واحد من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C3019H وNEB #C3019I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (NEB #C3019H وNEB #C3019I). توقع انخفاضًا بنسبة 40% تقريبًا. انخفاض في كفاءة التحويل عند التعرض لصدمة حرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المدة اللازمة لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C3019H وNEB #C3019I)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع خلايا NEB 10-beta المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. توقع انخفاضًا بنسبة 50% تقريبًا في كفاءة التحويل عند الحضانة لمدة 10 دقائق (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع أنبوب 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة أحادية الاستخدام، فإن أنبوب إيبندورف 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج ربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى تبلغ كفاءة التحويل 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). كما تنخفض إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix and Go" الذي يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي التي تم إنشاؤها باستخدام NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تركيبات الحمض النووي الناتجة متوافقة مع معظم خلايا E. coli المؤهلة. توصي NEB باستخدام خلايا E. coli المؤهلة من سلالة NEB 5-alpha (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كانت المنتجات المُجمَّعة أكبر من 15 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام خلايا E. coli المؤهلة من سلالة NEB 10-beta (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو خلايا E. coli المؤهلة كهربائيًا من سلالة NEB 10-beta (NEB #C3020). إذا احتوت الجينات المُجمَّعة على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام خلايا E. coli المؤهلة المستقرة من سلالة NEB (NEB #C3040). هل أنت محتار بشأن سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك أداة أخذ عينات خلايا E. coli المؤهلة للاستنساخ من NEB (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. سؤال: لماذا اختار عالم الأحياء التركيبية كريس فويغت من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا سلالة NEB 10-beta لتجميع الحمض النووي واستنساخه؟ جواب: هل تستطيع الخلية الحية القيام بذلك؟ الحوسبة؟ من خلال ترميز الدوائر في الحمض النووي وتحويلها إلى مضيف بكتيري حي، يمكن التلاعب بالكائنات الحية لمعالجة الإشارات البيئية وتغيير وظائفها البيولوجية. يُعدّ هذا التوظيف الجديد للوظائف البيولوجية حجر الزاوية في البيولوجيا التركيبية، وهو يُحدث تحولًا في أسواق مثل الوقود الحيوي وصناعة الأغذية من خلال هندسة كائنات حية جديدة مصممة للتصنيع أو الاستشعار البيولوجي. يتطلب تحقيق ذلك تجميعًا موثوقًا لبنى الحمض النووي الكبيرة ذات ترتيبات محددة لأجزاء الحمض النووي، وكائن حي موصوف بدقة لوضعها فيه. يُعدّ تصميم بنى الحمض النووي الكبيرة معقدًا، وقد يُمثّل التجميع تحديًا هائلًا. قام كريس فويغت، عالم الأحياء التركيبية في معهد برود، وفريقه بتطوير بيئة حاسوبية (سيلو) لتوحيد تصميم هذه التجميعات بناءً على معايير وقيود يُحددها المستخدم. وكما يُشير فويغت وفريقه، يعتمد سلوك الدوائر الجينية على العديد من الأجزاء التي قد تختلف وظائفها تبعًا للسياق الجيني والسلالة وظروف النمو. وعندما حان وقت اختيار سلالة خلوية مناسبة، وقع اختيارهم على NEB. بكتيريا الإشريكية القولونية 10-بيتا المؤهلة. لماذا تم اختيار سلالة NEB 10-بيتا لجهاز Cello؟ انخفاض معدل إعادة التركيب الناتج عن طفرة RecA1، القدرة على استنساخ وتكاثر البلازميدات الكبيرة، كفاءة تحويل عالية، نمو أفضل على وسط M9 مع الجلوكوز مقارنةً ببعض السلالات الأخرى، مقاومة لفيروس T1، نمط جيني محدد، مستخدمة بالفعل في العديد من المختبرات حول العالم. س: كيف يُخزن وسط NEB 10-بيتا/وسط النمو المستقر؟ ج: يمكن تخزين وسط NEB 10-بيتا/وسط النمو المستقر إما عند 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة، وذلك حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين عند 4 درجات مئوية. س: كيف تُجهز القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنقية القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا استُخدم الحمض النووي البلازميدي كقالب أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، فيمكن إزالته بمعالجة DpnI عند الضرورة. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل. إذا لم يكن ذلك ممكنًا، يُوصى بتنقية الجل. قد يُدخل استخلاص الجل ثيوسيانات الغوانيدين (من محلول الإذابة) مما قد يُقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، قُصّ شريحة الجل بحيث يُمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يُمكن إجراء هضم إنزيم التقييد للبلازميد متبوعًا بالتثبيط الحراري أو التنقية العمودية. يُمكن إعادة تعليق الشظايا المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع. س: هل يُمكن فصل تنسيق لوحة 96 بئرًا لبكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Competent E.coli، NEB #C3019P، إلى أقسام أصغر؟ ج: نعم. خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta معبأة في صفيحة بولي بروبيلين قابلة للتقسيم ذات 96 بئرًا ومغلقة بغشاء من رقائق الألومنيوم. يمكن تقسيم الصفيحة إلى أربعة أجزاء منفصلة، ​​كل جزء يحتوي على 24 بئرًا، عند إجراء عمليات تحويل على نطاق أصغر. لفصل جزء من 24 بئرًا، ضع صفيحة الـ 96 بئرًا على ثلج جاف، واثنِ الصفيحة عند نقاط التوصيل، ثم اقطع غشاء رقائق الألومنيوم بين الأجزاء. يجب إعادة الأجزاء غير المستخدمة إلى مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين. س: كيف تُقارن كفاءة التحويل في صفيحة الـ 96 بئرًا (NEB #C3019P) مع الصيغ الأخرى؟ ج: كفاءة التحويل (TE) لخلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (NEB #C3019P) في صفيحة الـ 96 بئرًا أقل من الصيغتين الأخريين، NEB #C3019H وNEB #C3019I. كفاءة التحويل لـ C3019P هي 1-3 × 108 وحدة تشكيل مستعمرة/ ميكروغرام pUC19.