نيو إنجلاند بيولابس، C3020K، NEB® 10-beta، بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة كهربائياً

مزود بوسط نمو مُحسَّن لـ NEB 10-beta وNEB Stable Compet. الفئات ذات الصلة: استنساخ سلالات الخلايا المؤهلة. التطبيقات: التحويل. المواصفات: مضاد حيوي لاختيار البلازميد. المضادات الحيوية لاختيار البلازميد. تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكنني حساب كفاءة التحويل الكهربائي (C3020)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (cfu) التي يمكن إنتاجها عن طريق تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم معين من الخلايا المؤهلة كهربائيًا. على سبيل المثال، إذا أسفر تحويل 10 بيكوغرام باستخدام البلازميد pUC19 عن 100 مستعمرة عند زرع 100 ميكرولتر من محلول مخفف بنسبة 1:100، فإن عدد المستعمرات لكل ميكروغرام يساوي 1.0 × 10¹⁰ (100 وحدة تشكيل مستعمرة/10 بيكوغرام × 10⁶ بيكوغرام/ميكروغرام × 1 مل/0.1 مل مزروع × 100 تخفيف). س: ما هي خصائص السلالة (C3020)؟ ج: الخصائص التي تُسهم في فائدتها كسلالة استنساخ موضحة أدناه. تظهر الأنماط الجينية المسؤولة عن هذه الخصائص بين قوسين. الفحص الأزرق/الأبيض: (يُنتج Φ80 Δ(lacZ)M15 جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز؛ بينما يحذف lacX74 جين بيتا-غالاكتوزيداز على الكروموسوم). يُشفّر البلازميد pUC19 والبلازميدات المشابهة الببتيد ألفا من بيتا-غالاكتوزيداز (lacZ). يمكن للببتيد ألفا أن يتحد مع جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز المحمول على F' (تكميل ألفا). عند إعادة تكوين بيتا-غالاكتوزيداز بهذه الطريقة، يمكنه شطر X-gal، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تؤدي الإدخالات المستنسخة في منطقة الربط المتعددة للبلازميد إلى تعطيل جين الببتيد ألفا، فتكون المستعمرات بيضاء. نقص إعادة التركيب: (recA) تمتلك الإشريكية القولونية نظام إصلاح يُعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. غالبًا ما تحتوي النسخ الجينومية على مناطق مكررة، وقد تُسبب عمليات إعادة الترتيب التي يتوسطها بروتين RecA مشاكل، خاصةً عندما تتجاوز مناطق التماثل 50 زوجًا قاعديًا. تميل السلالات التي تفتقر إلى جين recA إلى النمو ببطء أكبر من السلالات التي تحتوي عليه. نقص الإندونوكلياز I (endA): يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد: Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إنزيمًا داخليًا مقيدًا يقطع الحمض النووي في المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل خاص به، سيتم قطع الحمض النووي الغريب في هذه المواقع. يؤدي الحذف الموصوف أعلاه إلى إزالة كل من ناقل الميثيل والإنزيم الداخلي. نقص تقييد الميثيل: mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) تمتلك الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات، mcrA وmcrB وmrr، التي تقطع الحمض النووي بأنماط مثيلة موجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. لن يتم مثيلة الحمض النووي المشتق من شظايا PCR أو cDNA أو الحمض النووي الذي تم استنساخه مسبقًا في الإشريكية القولونية في هذه المواقع ولن يكون تم فصلها. تم تعطيل جميع إنزيمات Mcr الثلاثة في NEB 10-beta، مما يسمح بإدخال الحمض النووي حقيقي النواة ذي الأصل الجينومي (مثل المكتبات الأولية) إذا لزم الأمر. مقاومة العاثية T1: (fhuA) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي التي تم إنشاؤها باستخدام تجميع جيبسون؟ ج: تتوافق تركيبات الحمض النووي الناتجة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي NEB باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كانت المنتجات المُجمَّعة أكبر من 10 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهلة كهربائيًا (NEB #C3020). إذا كانت الجينات المُجمَّعة تحتوي على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable المُؤهلة (NEB #C3040). س: ما نوع الخلايا المُؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تركيبات الحمض النووي الناتجة متوافقة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المُؤهلة. توصي NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha المُؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كانت المنتجات المُجمَّعة أكبر من 15 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهلة كهربائيًا (NEB #C3020). إذا كانت الجينات المُجمَّعة تحتوي على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable المُؤهلة (NEB #C3040). يُنصح باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة (NEB #C3040). هل أنت محتار بشأن سلالة الاستنساخ المناسبة؟ تتيح لك عينة بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة للاستنساخ من NEB (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. س: كيف يُنصح بتخزين وسط نمو SOC؟ توصي عبوة SOC التي استلمتها مع خلاياي المؤهلة بالتخزين إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية، ولكن عند شرائها كمنتج مستقل، توصي بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. أيهما أفضل؟ ج: يمكن تخزين وسط SOC في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى ملاحظة أن وسط النمو 1.5 المرفق مع NEB #C2987R (لوحة واحدة بتنسيق 384 بئرًا) يجب تخزينه فقط في درجة حرارة الغرفة وإلا ستتكون بلورات. س: كيف ينبغي كيف أخزن وسط النمو المستقر NEB 10-beta؟ ج: يمكن تخزين وسط النمو المستقر NEB 10-beta في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة، وذلك حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). أما للتخزين طويل المدى، فنوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. س: كيف يتم تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنقية القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا تم استخدام الحمض النووي البلازميدي كقالب أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، فيمكن إزالته باستخدام معالجة DpnI إذا لزم الأمر. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا لم يكن ذلك ممكنًا، فنوصي بتنقية الجل. قد يؤدي استخلاص الجل إلى إدخال ثيوسيانات الغوانيدين (من عملية الذوبان). قد يؤدي استخدام محلول منظم (محلول مذيب) إلى تقليل كفاءة تفاعل التجميع. ولتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الجل بحيث يمكن استخدام كمية أقل من المحلول المنظم لإذابة الجل. يمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام عمود الفصل. يمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول منظم TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع.