نيو إنجلاند بيولابس، C3026J، سلالة إشريكية قولونية مؤهلة SHuffle® T7

الفئات ذات الصلة ذات الصلة: التعبير عن SHuffle، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، التطبيقات : التعبير عن T7، التعبير عن البروتينات الصعبة، التعبير عن البروتينات المرتبطة بروابط ثنائية الكبريتيد، المواصفات: مضاد حيوي لاختيار البلازميد، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف ، الأسئلة الشائعة : س: ما هي خصائص السلالة (C3026)؟ ج: الخصائص التي تساهم في فائدة هذه السلالة كسلالة للتعبير عن البروتين موضحة أدناه. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. التحكم في مُحفِّز اللاكتوز (lacIq): يمنع مثبط اللاكتوز التعبير من مُحفِّزات اللاكتوز، والتاك، والترس التي تحملها عادةً بلازميدات التعبير. إذا لم يكن مستوى مثبط اللاكتوز في خلايا الإشريكية القولونية كافيًا لتثبيط التعبير عبر هذه المُحفِّزات أثناء التحويل أو نمو الخلايا، فإن حتى المستويات المنخفضة من التعبير قد تُقلل من كفاءة التحويل وتؤدي إلى استبعاد المُحوَّلات المرغوبة. تُساعد جزيئات مثبط اللاكتوز الإضافية في سلالات lacIq على تقليل نشاط المُحفِّز إلى حين إضافة IPTG. تكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم: عادةً ما تُحافظ المختزلات في سيتوبلازم الإشريكية القولونية على السيستين في صورته المُختزلة، وبالتالي تُختزل أي رابطة ثنائي كبريتيد قد تتكون في هذا الحيز. تحتوي سلالة SHuffle على حذف لجينات مختزلة الغلوتاريدوكسين ومختزلة الثيوريدوكسين (Δgor ΔtrxB)، مما يسمح بتكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم. عادةً ما تكون هذه المجموعة من الطفرات قاتلة، ولكن يتم كبح فتكها بواسطة طفرة في إنزيم البيروكسيريدوكسين (ahpC*). بالإضافة إلى ذلك، يُنتج سلالة SHuffle نسخة من إنزيم DsbC، وهو إنزيم مُحَوِّل روابط ثنائي الكبريتيد الموجود في الفراغ المحيط بالخلية، والذي يفتقر إلى تسلسل الإشارة الخاص به، مما يُبقيه في السيتوبلازم. وقد ثبت أن هذا الإنزيم يعمل على البروتينات التي تحتوي على روابط ثنائي كبريتيد متعددة، لتصحيح الروابط المؤكسدة بشكل خاطئ وتعزيز الطي الصحيح. يوجد جين DsbC السيتوبلازمي على الكروموسوم. س: ما هي التطبيقات التي تُفيد فيها سلالات SHuffle®؟ ج: تُعد سلالات SHuffle مثالية لإنتاج البروتينات التي تتطلب روابط ثنائي الكبريتيد لطيها. ثبت أن إنزيم DsbC isomerase الموجود في كروموسوم سلالات SHuffle يعمل كبروتين مرافق فعال (Chen et al. (1999) JBC, 274, 19601-19605)، وقد يُساعد في طي البروتينات المستهدفة، بغض النظر عن تكوين روابط ثنائي الكبريتيد. (de Marco, A. (2009) Microbial Cell Factoryies, 8, 26) س: هل يحتوي بروتيني على روابط ثنائي الكبريتيد؟ ج: تحتوي جميع سيتوبلازمات حقيقيات النوى وبدائيات النوى المعروفة على مختزلات تُشارك في اختزال روابط ثنائي الكبريتيد. وبالتالي، تتأكسد البروتينات لتكوين روابط ثنائي الكبريتيد فقط في بعض الحجيرات خارج السيتوبلازم، مثل الحيز المحيط بالبلازما في بدائيات النوى سالبة الغرام، أو الشبكة الإندوبلازمية في حقيقيات النوى. قد تحدث استثناءات لهذه القاعدة في بعض أنواع العتائق المحبة للحرارة، مثل الكرينارشيا، وبعض أنواع البكتيريا المحبة للحرارة (مثل الأكويفكس والثرموتوغا). توجد مواقع إلكترونية مثل فوبيوس وسيجنال بي تُستخدم للتنبؤ بموقع البروتين، سواءً في الحيز المحيط بالبلازما المؤكسد أو في الشبكة الإندوبلازمية. ويمكن تكوين فكرة عن أهمية السيستين في بروتين معين من خلال تحليل مدى حفظ بقايا السيستين في البروتينات المتماثلة القريبة. س: أي سلالة من برنامج SHuffle® يجب أن أستخدم؟ ج: يوجد إصداران من برنامج SHuffle® مبنيان على سلالتين مختلفتين من بكتيريا الإشريكية القولونية. يعتمد SHuffle® T7 (NEB #C3026) على بكتيريا الإشريكية القولونية K12، بينما تعتمد كل من SHuffle® Express (NEB# C3028) وSHuffle® T7 Express (NEB# C3029) وSHuffle® Express T7 LysY (NEB# C3030) على بكتيريا الإشريكية القولونية B. وقد لاحظنا تفاوتًا في مستويات طي البروتين وتعبيره ضمن سلالتي خلايا SHuffle® المختلفتين (K12 مقابل B)، وذلك تبعًا لنوع البروتين. ولا يمكننا حاليًا التنبؤ بأي من سلالتي خلايا SHuffle® ستكون أكثر نجاحًا في طي بروتين معين مرتبط بروابط ثنائية الكبريتيد. لذا، نوصي بمقارنة تعبير البروتين المطلوب في كلتا سلالتي SHuffle® (NEB #C3026 و#C3029) كتجربة أولية. وبمجرد تحديد سلالة SHuffle® المثلى، يُنصح بتحسين ظروف التعبير (مثل درجة الحرارة، وقوة المحفز، والتوقيت، وما إلى ذلك). يمكن استخدام جميع سلالات SHuffle مع محفزات غير T7 (مثل نواقل التعبير عن محفزات lac و ara). بالنسبة لنواقل التعبير عن محفزات T7، نوصي إما بـ SHuffle T7 Express (NEB #C3029) أو SHuffle T7 (NEB #C3026). أما للتعبير عن محفزات T7 السامة، فنوصي بـ SHuffle® T7 Express lysY (NEB #C3030). س: هل هناك أي شيء يمكنني فعله لزيادة إنتاج البروتين عند استخدام سلالات SHuffle؟ ج: جرب تغيير قوة التحفيز ومدته ودرجة حرارته للعثور على ظروف التعبير المثلى. قد يؤدي خفض قوة التعبير إلى تحسين الإنتاج. س: ما هي خصائص نمو سلالات SHuffle؟ ج: تصل سلالات SHuffle إلى قيم امتصاص ضوئي نهائية مماثلة لسلالاتها الأصلية البرية. ومع ذلك، لاحظنا مرحلة كمون أطول في سلالات SHuffle مقارنةً بالخلايا البرية. س: كيف تساعد سلالات SHuffle® في تكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم؟ ج: سلالة SHuffle هي سلالة متحولة من بكتيريا الإشريكية القولونية تفتقر إلى إنزيمي الاختزال (trxB و gor) مع طفرة كابتة إضافية (ahpC) تُعيد إليها حيويتها، مما يسمح بتكوين روابط ثنائية الكبريتيد مستقرة في السيتوبلازم. في ظل هذه الظروف، تكون الثيوريدوكسينات في حالتها المؤكسدة، فتحول من إنزيمات اختزال إلى إنزيمات أكسدة. وبالتالي، يمكن أكسدة البروتينات التي تتطلب روابط ثنائية الكبريتيد لتكوينها، وتكوين روابط ثنائية الكبريتيد مستقرة داخل السيتوبلازم. بالإضافة إلى ذلك، تُعبر سلالات SHuffle عن إنزيم إيزوميراز الرابطة ثنائية الكبريتيد DsbC داخل السيتوبلازم. تُعزز هذه الخاصية بشكل كبير دقة تكوين الروابط ثنائية الكبريتيد في السيتوبلازم، وتتأكسد البروتينات التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد متعددة بشكل صحيح، مما يؤدي إلى زيادة ملحوظة في الإنتاجية. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة لـ NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءتها الإنتاجية بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. وفقدت الخلايا 98.9% من كفاءتها الإنتاجية بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند -20 درجة مئوية. س: كيف يمكنني التعبير عن البروتين الذي أرغب به في SHuffle؟ ج: نوصي في البداية باستخدام وسط غذائي غني عند 30 درجة مئوية. وإلا، يمكن استخدام وسط غذائي طوال الليل عند 16 درجة مئوية. عند 30 درجة مئوية أو 16 درجة مئوية، قم بتلقيح 1% من مزرعة ليلية، ثم قم بتنمية الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.8، ثم حفز التعبير عن البروتين لمدة 5 ساعات على الأقل عند 30 درجة مئوية أو طوال الليل عند 16 درجة مئوية. في حال استخدام درجة حرارة 37 درجة مئوية، قم بتلقيح 1% من مزرعة ليلية، ثم قم بتنمية الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.8، ثم حفز إنتاج البروتين لمدة 6 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية. س: هل يلزم إضافة الستربتومايسين و/أو السبيكتينومايسين عند تنمية سلالات SHuffle؟ ج: لا، تعود مقاومة هذه المضادات الحيوية إلى جينات مدمجة بشكل ثابت في الكروموسوم. يجب تجنب بلازميدات التعبير التي تحمل علامات مقاومة الستربتومايسين أو السبيكتينومايسين. س: هل يمكنني إجراء تجارب عرض عاثية M13 على سلالات SHuffle؟ ج: لا. خلايا SHuffle Express (C3028، C3029، C3030) لا تحمل الإبيسوم F'، وبالتالي لا يمكن إصابتها بعدوى M13. من ناحية أخرى، على الرغم من أن خلايا SHuffle T7 (C3026) تحمل F'، إلا أنها غير قابلة للإصابة بعدوى M13. قد يعود ذلك إلى تداخل السيتوبلازم المؤكسد مع تجميع العاثيات. س: هل يمكنني إجراء فحص أزرق/أبيض باستخدام تكميل ألفا لجين lacZ في سلالات SHuffle؟ ج: لا، سلالات SHuffle لا تحتوي على حذف M15 المناسب في جين lacZ للتكميل ألفا. خلايا SHuffle (E. coli K12، C3026) وخلايا SHuffle express (E. coli B، C3028) هي lacZ+، بينما خلايا SHuffle T7 express (E. coli B، C3029 وC3030) هي lacZ-. س: ما هي سلالات SHuffle المقاومة للكلورامفينيكول؟ هل الكلورامفينيكول ضروري للحفاظ على بلازميد mini F؟ ج: فقط سلالات SHuffle® T7 Express lysY Competent E. coli (NEB #C3030) مقاومة للكلورامفينيكول. تعود مقاومة الكلورامفينيكول إلى بلازميد miniF الذي يحمل جين lysY. إن بكتيريا الإشريكية القولونية SHuffle® T7 Express Competent E. coli (NEB #C3029) حساسة للكلورامفينيكول. ليس من الضروري إضافة الكلورامفينيكول لتكاثر بكتيريا miniF. لا نوصي بإضافة الكلورامفينيكول إلى مزارع بكتيريا الإشريكية القولونية SHuffle® T7 lysY Competent E. coli (NEB #C3027) أو بكتيريا الإشريكية القولونية SHuffle® T7 Express lysY Competent E. coli (NEB #C3030). يوجد نسخة واحدة من جين مقاومة الكلورامفينيكول على بكتيريا miniF، لذا لا يمكن استخدام التركيزات القياسية للكلورامفينيكول (33 ميكروغرام/مل). في حال إضافة الكلورامفينيكول، استخدم 10 ميكروغرام/مل فقط. س: هل تنمو خلايا SHuffle في بيئات غذائية بسيطة؟ ج: تنمو خلايا SHuffle express (E. coli B) (C3028، C3029، C3030) في وسط غذائي بسيط، بينما تُعد خلايا SHuffle (E. coli K12) ذاتية التغذية وتتطلب إضافة الإيزولوسين والليوسين (50 ميكروغرام/مل) للنمو في وسط غذائي بسيط. يمكن تحضير محاليل مركزة 100 ضعف من الإيزولوسين/الليوسين بإذابة 5 ملغ/مل من الأحماض الأمينية في الماء وتعقيم المحلول بالترشيح. س: هل سلالات SHuffle حساسة لدرجة الحرارة؟ ج: خلايا SHuffle express حساسة لدرجات الحرارة المرتفعة ولا تنمو عند 42 درجة مئوية. ولكن عند درجات حرارة 37 درجة مئوية وما دون، تكون كل من خلايا SHuffle express (E. coli B) وخلايا SHuffle (E. coli K12) قابلة للحياة. لذلك نقترح زراعة خلايا SHuffle في درجة حرارة 30 درجة مئوية غير مُجهدة وتحفيز إنتاج البروتين الخاص بك عند درجات حرارة أقل. س: هل جينوم سلالات SHuffle متاح؟ ج: نعم. يمكنكم الاطلاع على الورقة البحثية التي تصف الجينوم الكامل المُعَلَّم لكلٍّ من النسخة K-12 من سلالة SHuffle (C3026) والنسخة B (C3029) في مجلة Genome Announcements (2016) بتاريخ 31 مارس؛ 4(2). وقد تم إيداع تسلسلات الجينوم الكاملة المُعَلَّمة في EMBL وEBI تحت أرقام الوصول التالية: NEB T7 express (C2566)، CP014268؛ SHuffle-B (C3029)، CP014269؛ DHB4، CP014270، ونظيره F′، CP014271؛ وSHuffle K-12 (C3026)، CP014272، ونظيره F′، CP014273. سؤال: هل يخضع التعبير عن T7 لتثبيط الكاتابوليت في سلالات NEB T7 Express أو SHuffle؟ ج: يتم استنساخ جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 في أوبيرون اللاكتوز الكروموسومي. وبما أن التعبير الجيني يُتحكم فيه بواسطة أوبيرون اللاكتوز الطبيعي، فإن إضافة الجلوكوز ستؤدي إلى تثبيط استقلابي. وبالتالي، سيكون التعبير الأساسي للبروتين من نواقل محفز T7 أكثر تحكمًا عند وجود الجلوكوز في الوسط. وعندما يكون الجلسرين هو المصدر الأساسي للكربون، فلن يكون هناك أي تأثير على أوبيرون اللاكتوز. س: هل يمكن استخدام خلايا SHuffle لإفراز البروتين الذي أرغب فيه؟ ج: على الرغم من أن خلايا SHuffle تمتلك جهاز إفراز سليم، إلا أنه لا يُنصح بإنتاج البروتينات في الفراغ المحيط بالخلية باستخدام خلايا SHuffle. إذ يمكن أن تتأكسد البروتينات التي تتطلب روابط ثنائية الكبريتيد لطيها في السيتوبلازم قبل إفرازها، مما يعيق إفرازها.