نيو إنجلاند بيولابس، C3028J، بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة SHuffle® Express

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة : التعبير عن البروتينات، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، تطبيقات التعبير عن البروتينات الصعبة، التعبير عن البروتينات المرتبطة بروابط ثنائية الكبريتيد، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل. ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف. الأسئلة الشائعة : س: ما هي خصائص السلالة (C3028)؟ ج: الخصائص التي تساهم في فائدتها كسلالة للتعبير عن البروتين موضحة أدناه. الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص تظهر بين قوسين. تكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم: عادةً ما تحافظ المختزلات في سيتوبلازم الإشريكية القولونية على السيستين في صورته المختزلة، مما يؤدي إلى اختزال أي رابطة ثنائي كبريتيد قد تتكون في هذا الحيز. يحتوي سلالة SHuffle على حذف لجينات مختزلة الغلوتاريدوكسين ومختزلة الثيوريدوكسين (Δgor ΔtrxB)، مما يسمح بتكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم. عادةً ما يكون هذا المزيج من الطفرات مميتًا، ولكن يتم كبح هذه الفتك بواسطة طفرة في إنزيم البيروكسيريدوكسين (ahpC*). بالإضافة إلى ذلك، تُنتج سلالة SHuffle نسخة من إنزيم DsbC، وهو إنزيم إيزوميراز رابطة ثنائي الكبريتيد الموجود في الفراغ المحيط بالخلية، والذي يفتقر إلى تسلسل الإشارة الخاص به، مما يبقيه في السيتوبلازم. وقد ثبت أن هذا الإنزيم يعمل على البروتينات التي تحتوي على روابط ثنائي كبريتيد متعددة، لتصحيح الروابط المؤكسدة بشكل خاطئ وتعزيز الطي الصحيح. يوجد جين DsbC السيتوبلازمي على الكروموسوم. نقص الإندونوكلياز I (endA1): يحتوي الحيز المحيط بالبلازم في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضّرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، مما يُحسّن جودة تحضيرات البلازميدات بشكل ملحوظ. نقص البروتياز ([lon] ompT): تفتقر سلالات الإشريكية القولونية B بشكل طبيعي إلى بروتياز lon، الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد بروتياز OmpT على سطح الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالتي K-12 وB، ويُفترض أنه يُساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. الخلايا التي تفتقر إلى كلا البروتيازين أكثر استجابة لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. يمكن أن تساعد طفرات جينات أخرى في تخفيف الآثار الضارة أحيانًا لعيوب البروتياز هذه (مثل sulA، أدناه). مقاومة العاثية T1 (fhuA2): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يُكسب حذف هذا الجين مقاومة لهذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: ما هي التطبيقات التي تُفيد فيها سلالات SHuffle®؟ ج: تُعد سلالات SHuffle مثالية للتعبير عن البروتينات التي تتطلب روابط ثنائية الكبريتيد لطيها. كما ثبت أن إنزيم DsbC إيزوميراز الموجود في كروموسوم سلالات SHuffle يُعد بروتينًا مرافقًا فعالًا (Chen et al. (1999) JBC, 274, 19601-19605) وقد يُساعد في طي البروتينات المستهدفة، بغض النظر عن تكوين روابط ثنائية الكبريتيد. (دي ماركو، أ. (2009) مصانع الخلايا الميكروبية، 8، 26) س: هل يحتوي البروتين الخاص بي على روابط ثنائية الكبريتيد؟ ج: تحتوي جميع سيتوبلازمات حقيقيات النوى وبدائيات النوى المعروفة على مختزلات تشارك في اختزال روابط ثنائية الكبريتيد. وبالتالي، تتأكسد البروتينات لتكوين روابط ثنائية الكبريتيد فقط في بعض الحجيرات خارج السيتوبلازم، مثل الحيز المحيط بالبلازما في بدائيات النوى سالبة الغرام، أو الشبكة الإندوبلازمية في حقيقيات النوى. قد تحدث استثناءات لهذه القاعدة في بعض العتائق المحبة للحرارة، مثل الكرينارشيا، وبعض البكتيريا المحبة للحرارة (مثل الأكويفكس والثرموتوغا). توجد مواقع إلكترونية مثل فوبيوس أو سيجنال بي يمكن استخدامها للتنبؤ بما إذا كان البروتين موجودًا في الحيز المحيط بالبلازما المؤكسد أو الشبكة الإندوبلازمية. يمكن للمرء أن يحصل على فكرة عن أهمية السيستين في بروتين معين من خلال تحليل مدى حفظ بقايا السيستين في المتماثلات القريبة. س: أي سلالة من SHuffle® يجب أن أستخدم؟ ج: يوجد إصداران من SHuffle® مبنيان على سلالتين مختلفتين من الإشريكية القولونية. SHuffle® T7 (NEB #C3026) مبني على الإشريكية القولونية K12، بينما SHuffle® Express (NEB# C3028)، وSHuffle® T7 Express (NEB# C3029)، وSHuffle® Express T7 LysY (NEB# C3030) مبنية جميعها على الإشريكية القولونية B. لاحظنا تفاوتًا في مستويات الطي والتعبير في خطي خلايا SHuffle® المختلفين (K12 مقابل B)، وذلك تبعًا للبروتين. حاليًا، لا يمكننا التنبؤ بأي خط من خلايا SHuffle® سيكون أكثر نجاحًا في طي بروتين معين مرتبط بروابط ثنائية الكبريتيد. لذلك، نوصي بمقارنة تعبير البروتين الذي ترغبون في دراسته في كلا سلالتي SHuffle® (NEB #C3026 و#C3029) كتجربة أولية. بمجرد تحديد سلالة SHuffle® المثلى، يُنصح بتحسين ظروف التعبير الجيني (مثل درجة الحرارة، وقوة المُحفِّز، وتوقيته، إلخ). يمكن استخدام جميع سلالات SHuffle مع مُحفِّزات غير T7 (مثل نواقل التعبير عن مُحفِّزات lac وara). بالنسبة لنواقل التعبير عن مُحفِّزات T7، نوصي إما بـ SHuffle T7 Express (NEB #C3029) أو SHuffle T7 (NEB #C3026). أما للتعبير عن مُحفِّزات T7 السامة، فنوصي بـ SHuffle® T7 Express lysY (NEB #C3030). س: هل هناك أي شيء يمكنني فعله لزيادة إنتاج البروتين عند استخدام سلالات SHuffle؟ ج: جرِّب تغيير قوة التحفيز ومدته ودرجة الحرارة للعثور على ظروف التعبير المثلى. قد يؤدي خفض قوة التعبير إلى تحسين الإنتاج. س: ما هي خصائص نمو سلالات SHuffle؟ ج: تصل سلالات SHuffle إلى قيم امتصاص ضوئي نهائية مماثلة لسلالاتها الأصلية. ومع ذلك، لاحظنا فترة كمون أطول في سلالات SHuffle مقارنةً بالخلايا الأصلية. س: كيف تُساعد سلالات SHuffle® في تكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم؟ ج: SHuffle هي سلالة متحولة من بكتيريا الإشريكية القولونية تفتقر إلى إنزيمي الاختزال (trxB وgor) مع طفرة كابتة إضافية (ahpC) تُعيد إليها حيويتها، مما يسمح بتكوين روابط ثنائي الكبريتيد مستقرة في السيتوبلازم. في ظل هذه الظروف، تكون الثيوريدوكسينات في حالتها المؤكسدة، مما يحولها من إنزيمات اختزال إلى إنزيمات أكسدة. وبالتالي، يمكن أكسدة البروتينات التي تتطلب روابط ثنائي الكبريتيد لطيها وتكوين روابط ثنائي الكبريتيد مستقرة داخل السيتوبلازم. بالإضافة إلى ذلك، تُعبر سلالات SHuffle عن إنزيم إيزوميراز رابطة ثنائي الكبريتيد DsbC داخل السيتوبلازم. تُعزز هذه الخاصية بشكل كبير دقة تكوين روابط ثنائي الكبريتيد في السيتوبلازم، وتتأكسد البروتينات التي تحتوي على روابط ثنائي الكبريتيد متعددة بشكل صحيح لإنتاج كميات أكبر بكثير. س: هل يُمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. يؤدي التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى انخفاض ملحوظ في كفاءة التحويل (TE). عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة للتحويل NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. كما فقدت 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: كيف يمكنني التعبير عن البروتين المطلوب في SHuffle؟ ج: نوصي في البداية باستخدام وسط غذائي غني عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. وإلا، يمكن استخدام وسط غذائي طوال الليل عند درجة حرارة 16 درجة مئوية. عند درجة حرارة 30 درجة مئوية أو 16 درجة مئوية، قم بتلقيح 1% من مزرعة الخلايا الليلية، ثم قم بتنمية الخلايا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.8، ثم حفز التعبير عن البروتين لمدة 5 ساعات على الأقل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية أو طوال الليل عند درجة حرارة 16 درجة مئوية. في حال استخدام درجة حرارة 37 درجة مئوية، قم بتلقيح 1% من مزرعة ليلية، ثم قم بتنمية الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.8، ثم حفز إنتاج البروتين لمدة 6 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية. س: هل يلزم إضافة الستربتومايسين و/أو السبيكتينومايسين عند تنمية سلالات SHuffle؟ ج: لا، تعود مقاومة هذه المضادات الحيوية إلى جينات مدمجة بشكل ثابت في الكروموسوم. يجب تجنب بلازميدات التعبير التي تحمل علامات مقاومة الستربتومايسين أو السبيكتينومايسين. س: هل يمكنني إجراء تجارب عرض عاثية M13 على سلالات SHuffle؟ ج: لا. خلايا SHuffle Express (C3028، C3029، C3030) لا تحمل الإبيسوم F'، وبالتالي لا يمكن إصابتها بعدوى M13. من ناحية أخرى، على الرغم من أن خلايا SHuffle T7 (C3026) تحمل F'، إلا أنها غير قابلة للإصابة بعدوى M13. قد يعود ذلك إلى تداخل السيتوبلازم المؤكسد مع تجميع العاثيات. س: هل يمكنني إجراء فحص أزرق/أبيض باستخدام تكميل ألفا لجين lacZ في سلالات SHuffle؟ ج: لا، سلالات SHuffle لا تحتوي على حذف M15 المناسب في جين lacZ للتكميل ألفا. خلايا SHuffle (E. coli K12، C3026) وخلايا SHuffle express (E. coli B، C3028) هي lacZ+، بينما خلايا SHuffle T7 express (E. coli B، C3029 وC3030) هي lacZ-. س: ما هي سلالات SHuffle المقاومة للكلورامفينيكول؟ هل الكلورامفينيكول ضروري للحفاظ على بلازميد mini F؟ ج: فقط سلالات SHuffle® T7 Express lysY Competent E. coli (NEB #C3030) مقاومة للكلورامفينيكول. تعود مقاومة الكلورامفينيكول إلى بلازميد miniF الذي يحمل جين lysY. إن بكتيريا الإشريكية القولونية SHuffle® T7 Express Competent E. coli (NEB #C3029) حساسة للكلورامفينيكول. ليس من الضروري إضافة الكلورامفينيكول لتكاثر بكتيريا miniF. لا نوصي بإضافة الكلورامفينيكول إلى مزارع بكتيريا الإشريكية القولونية SHuffle® T7 lysY Competent E. coli (NEB #C3027) أو بكتيريا الإشريكية القولونية SHuffle® T7 Express lysY Competent E. coli (NEB #C3030). يوجد نسخة واحدة من جين مقاومة الكلورامفينيكول على بكتيريا miniF، لذا لا يمكن استخدام التركيزات القياسية للكلورامفينيكول (33 ميكروغرام/مل). في حال إضافة الكلورامفينيكول، استخدم 10 ميكروغرام/مل فقط. س: هل تنمو خلايا SHuffle في بيئات غذائية بسيطة؟ ج: تنمو خلايا SHuffle express (E. coli B) (C3028، C3029، C3030) في وسط غذائي بسيط، بينما تُعد خلايا SHuffle (E. coli K12) ذاتية التغذية وتتطلب إضافة الإيزولوسين والليوسين (50 ميكروغرام/مل) للنمو في وسط غذائي بسيط. يمكن تحضير محاليل مركزة 100 ضعف من الإيزولوسين/الليوسين بإذابة 5 ملغ/مل من الأحماض الأمينية في الماء وتعقيم المحلول بالترشيح. س: هل سلالات SHuffle حساسة لدرجة الحرارة؟ ج: خلايا SHuffle express حساسة لدرجات الحرارة المرتفعة ولا تنمو عند 42 درجة مئوية. ولكن عند درجات حرارة 37 درجة مئوية وما دون، تكون كل من خلايا SHuffle express (E. coli B) وخلايا SHuffle (E. coli K12) قابلة للحياة. لذلك نقترح زراعة خلايا SHuffle في درجة حرارة 30 درجة مئوية غير مُجهدة وتحفيز إنتاج البروتين الخاص بك عند درجات حرارة أقل. س: هل جينوم سلالات SHuffle متاح؟ ج: نعم. يمكنكم الاطلاع على الورقة البحثية التي تصف الجينوم الكامل المُعَلَّم لكلٍّ من نسخة K-12 من SHuffle (C3026) ونسخة B (C3029) في Genome Announcements (2016) 31 مارس؛ 4(2). وقد أُودِعت تسلسلات الجينوم الكاملة المُعَلَّمة في EMBL وEBI، تحت أرقام الوصول التالية: NEB T7 express (C2566)، CP014268؛ SHuffle-B (C3029)، CP014269؛ DHB4، CP014270، ونظيره F′، CP014271؛ وSHuffle K-12 (C3026)، CP014272، ونظيره F′، CP014273. سؤال: هل يمكن استخدام خلايا SHuffle لإفراز البروتين الذي أبحث عنه؟ ج: على الرغم من أن خلايا SHuffle تمتلك جهاز إفراز سليم، إلا أنه لا يُنصح بإنتاج البروتينات في الفراغ المحيط بالخلية باستخدام هذه الخلايا. فالبروتينات التي تتطلب روابط ثنائية الكبريتيد لتكوين بنيتها قد تتأكسد في السيتوبلازم قبل إفرازها، مما يعيق عملية الإفراز.