نيو إنجلاند بيولابس، C3037I، NEBExpress® Iq Competent E. coli (عالية الكفاءة)

هل تواجه صعوبة في فتح الأنابيب؟ الفئات ذات الصلة: التعبير غير T7، سلالات التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، الإشريكية القولونية، سلالات التعبير، التطبيقات ، التعبير غير T7، التعبير عن البروتين في الإشريكية القولونية، مواصفات التعبير عن البروتين ، المضاد الحيوي لاختيار البلازميد، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ستربتوميسين 25 ميكروغرام/مل، تتراسيكلين 15 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن : يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة: س: هل تقدم شركة نيو إنجلاند بيولابس سلالات من الإشريكية القولونية المؤهلة والمناسبة للتعبير عن البروتين؟ ج: نعم، لدينا العديد من السلالات للتعبير عن البروتين. يُقدَّم السلالة BL21(DE3) (NEB #C2527) للتعبير الروتيني باستخدام T7، بينما تُقدَّم السلالة BL21 (NEB #C2530) للتعبير غير المعتمد على T7. أما السلالة NEBExpress (NEB #C2523) فهي مشتق مُحسَّن من BL21، بينما تُتيح السلالة NEB Express Iq (NEB #C3037) تحكمًا دقيقًا في التعبير من نواقل تحتوي على مُحفِّزات lac أو tac أو trc أو T5-lac0. وتُعدّ سلالتا T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) وT7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) مشتقات مُحسَّنة من BL21(DE3). تُتيح سلالة lacIq تحكمًا أدق في التعبير. وتتوفر كلتا السلالتين مع خاصية lysY لتحكم استثنائي في التعبير (T7 Express lysY، NEB #C3010 وT7 Express lysY/Iq، NEB #C3013). تُقدّم شركة NEB أيضًا سلالات SHuffle™ القادرة على طي البروتينات بشكل صحيح، حتى تلك التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد متعددة في السيتوبلازم. يُمكن استخدام SHuffle™ Express (NEB #C3028H) مع مُحفّزات غير T7، أو SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) مع نواقل التعبير عن مُحفّز T7. أما للتعبير عن مُحفّز T7 السام، فإن SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) هو الخيار الأمثل. تُقدّم هذه السلالات الثلاث أيضًا كسلالات K12: SHuffle™ (NEB #C3025H)، وSHuffle™ T7 (NEB #C3026H)، وSHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). يتوفر Lemo21(DE3) (NEB #C2528) للتعبير القابل للضبط عن أهداف صعبة، مثل البروتينات الغشائية، والبروتينات السامة، والبروتينات المعرضة للتعبير غير الذائب. تم تصميم NiCo21(DE3) (NEB #C2529) للتعبير الروتيني عن البروتينات الموسومة بالهيستيدين وتنقيها. س: ما هي المدة اللازمة لحضانة الخلايا على الجليد بعد إضافة الحمض النووي (NEB #C3037H وNEB #C3037I)؟ ج: يُوصى بحضانة الحمض النووي مع خلايا NEB Express Iq المؤهلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. توقع انخفاضًا بنسبة 40% تقريبًا في كفاءة التحويل عند الحضانة لمدة 10 دقائق (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: ما هي المحاليل/الوصفات (C3037)؟ ج: SOB: 2% ببتون نباتي (أو تريبتون) 0.5% مستخلص خميرة 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم SOC: SOB + 20 ملي مولار جلوكوز LB أجار: 1% تريبتون 0.5% مستخلص خميرة 0.17 مولار كلوريد الصوديوم 1.5% أجار س: ما هي خصائص السلالة (C3037)؟ ج: الخصائص التي تساهم في فائدة هذه السلالة كسلالة للتعبير عن البروتين موصوفة أدناه. الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص تظهر بين قوسين. نقص البروتياز ([lon] ompT): سلالات الإشريكية القولونية B تعاني من نقص طبيعي في بروتياز lon الذي يعمل في سلالات K-12 على تحليل البروتينات المطوية بشكل خاطئ ومنع تراكم بعض البروتينات الخاصة بدورة الخلية. يتواجد إنزيم OmpT البروتيني على سطح بكتيريا الإشريكية القولونية من النوع البري في كل من سلالتي K-12 وB، ويُفترض أنه يُساعد الخلايا على استخلاص الأحماض الأمينية من بيئتها الخارجية. وتكون الخلايا التي تفتقر إلى هذين الإنزيمين البروتينيين أكثر استجابةً لإنتاج البروتينات من الجينات المستنسخة. التحكم في مُحفِّز اللاكتوز (lacIq): يعمل مثبط اللاكتوز على منع التعبير من مُحفِّزات lac وtac وtrc التي تحملها عادةً بلازميدات التعبير. إذا لم يكن مستوى مثبط اللاكتوز في خلايا الإشريكية القولونية كافيًا لتثبيط التعبير عبر هذه المُحفِّزات أثناء التحول أو نمو الخلايا، فإن حتى المستويات المنخفضة من التعبير عن الجينات السامة يُمكن أن تُقلل من كفاءة التحول وتؤدي إلى استبعاد المُحوَّلات المرغوبة. تُساعد الجزيئات الإضافية من مثبط اللاكتوز في سلالات lacIq على تقليل نشاط المُحفِّز إلى أن تتم إضافة IPTG. التعافي من تلف الحمض النووي (sulA11): تستطيع خلايا الإشريكية القولونية تحمُّل قدر كبير من تلف الحمض النووي المزمن طالما سُمح للإصلاح بالاستمرار. وتتأثر هذه القدرة سلبًا إذا لم تتمكن الخلايا من الانقسام بعد الإصلاح. في خلايا Lon-، يتراكم بروتين SulA، وهو مثبط لانقسام الخلايا، مما يجعل الخلايا شديدة الحساسية لتلف الحمض النووي. تسمح طفرة sulA للخلايا بالانقسام بشكل طبيعي في غياب بروتياز Lon. نقص الإندونوكلياز I: (endA) تحتوي المساحة المحيطة بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تحذف طفرة endA هذا الإندونوكلياز، ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10) تحمل سلالات الإشريكية القولونية B من النوع البري إندونوكلياز تقييد من النوع الأول، والذي يقطع الحمض النووي عند الموقع TGA(N8)TGCT. بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل مُناسب، سيتم قطع الحمض النووي الغريب عند هذه المواقع. يؤدي الحذف الموصوف أعلاه إلى إزالة كل من ناقل الميثيل والإندونوكلياز. مقاومة العاثية T1: (fhuA2) تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في بكتيريا الإشريكية القولونية لكي تُصيب الخلايا. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل ملحوظ على خصائص التحول أو النمو للخلية. س: ما الفرق بين NEB #C3037H وNEB #C3037I؟ ج: إنهما نفس الخلايا بنفس الكفاءة، ولكنهما متوفرتان بأشكال مختلفة. تُعبأ C3037H في 20 أنبوب تحويل للاستخدام لمرة واحدة، يحتوي كل منها على 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يمكن إضافة البلازميد أو ناتج الربط مباشرةً إلى أنابيب التحويل لسهولة الاستخدام. تُعبأ C3037I في 6 أنابيب، يحتوي كل منها على 200 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. يجب إذابة الأنابيب على الجليد ونقل 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب جديدة قبل التحويل. تحتوي كل أنبوبة على خلايا كافية لأربع عمليات تحويل، مما يقلل من تكلفة كل عملية. يُعد استخدام سلالة C3037I خيارًا اقتصاديًا عند إجراء ثلاث أو أربع عمليات تحويل في وقت واحد. لا يُنصح بإعادة تجميد الخلايا المؤهلة بعد إذابتها، لأن ذلك سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل. س: ما هو الوقت الأمثل للصدمة الحرارية لهذه السلالة (NEB #C3037H وNEB #C3037I)؟ ج: تؤدي الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 20 ثانية إلى أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Express Iq (NEB #C3037H وNEB #C3037I). توقع انخفاضًا في كفاءة التحويل بنسبة 50% تقريبًا عند التعرض للصدمة الحرارية لمدة 80 ثانية (انظر الشكل في صفحة المنتج الرئيسية). س: لماذا لا تتكون مستعمرات أو لا يوجد نمو في المزرعة السائلة (C3037)؟ ج: قد يكون هناك تعبير أساسي في مضيف NEB Express. إذا كان من المحتمل حدوث سمية للبروتين المُعبَّر عنه، فإن: » الحضانة عند 30 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة قد تُخفف من مشاكل السمية. » بالإضافة إلى ذلك، تحقق من تركيز المضاد الحيوي (اختبره باستخدام بلازميد تحكم). س: لماذا يكون البروتين المُحفَّز غير قابل للذوبان (C3037)؟ ج: تحقق من عدم الذوبان - هذا مهم لأن التعبير العالي وإنتاج البروتين بكميات كبيرة قد يؤديان إلى أن يصبح البروتين المستهدف غير قابل للذوبان. الحلول المحتملة لذلك هي: » التحفيز في درجات حرارة منخفضة (تصل إلى 12-15 درجة مئوية طوال الليل) » تقليل تركيز IPTG إلى ما بين 0.01 ملي مولار و0.1 ملي مولار » التحفيز لفترة أقصر (تصل إلى 15 دقيقة) » التحفيز في وقت مبكر من النمو (OD600 = 0.3 أو 0.4) س: لماذا لا يوجد بروتين مرئي على الهلام أو لا يوجد نشاط (C3037)؟ ج: تحقق من السمية - قد يعني عدم وجود بروتين أن الخلايا قد تخلصت من عناصر في بلازميد التعبير أو حذفتها. » استزرع الخلايا لتحفيز البروتين. قبل بدء عملية التحفيز مباشرةً، قم بزراعة عينة على طبقين متطابقين، أحدهما يحتوي على مضاد حيوي والآخر لا يحتوي عليه. إذا كانت السمية مشكلة، فسيكون هناك فرق ملحوظ في عدد المستعمرات على الطبقين. سيظهر عدد أقل من المستعمرات على الأطباق التي تحتوي على المضاد الحيوي (مما يشير إلى فقدان البلازميد) مقارنةً بالأطباق الخالية منه. س: هل يمكنني تخزين الخلايا المؤهلة عند -20 درجة مئوية بدلاً من -80 درجة مئوية؟ ج: يجب تخزين الخلايا المؤهلة عند -80 درجة مئوية. سيؤدي التخزين عند -20 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة التحويل. عند اختبارها على بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987H)، فقدت الخلايا 94.5% من كفاءة التحويل بعد 24 ساعة فقط من التخزين عند -20 درجة مئوية. وفقدت الخلايا 98.9% من كفاءة التحويل بعد يومين، و99.6% بعد أسبوع من التخزين عند -20 درجة مئوية. س: ما هي مدة صلاحية هذه السلالة (NEB #C3037H وNEB #C3037I)؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية سنتان من تاريخ بيانات التحليل المرفقة مع المنتج. س: ما نوع أنابيب التحويل التي يجب استخدامها؟ ج: بالمقارنة مع أنبوب 2.0 مل المرفق مع خلايا NEB المؤهلة للاستخدام لمرة واحدة، فإن أنبوب إيبندورف 1.5 مل الذي اختبرناه كان مناسبًا تمامًا. س: ما حجم الحمض النووي الذي يمكن إضافته إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المراد إضافته إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). تنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (بدلاً من 2 ميكرولتر). س: هل خلايا NEB المؤهلة متوافقة مع بروتوكول "Mix & Go"؟ ج: يوجد بروتوكول "Mix & Go" يوفر طريقة سريعة لتحويل الخلايا ببساطة عن طريق إضافة البلازميد إلى الخلايا وزرعها. لا حاجة لخطوة الصدمة الحرارية. اختبرت NEB خلاياها المؤهلة في هذا البروتوكول مقابل منتج "Mix & Go" لشركة أخرى. لاحظنا أن كلا المنتجين ينتجان أعدادًا متقاربة من المستعمرات؛ ومع ذلك، فإن مستعمرات NEB أكبر حجمًا باستخدام نفس فترة الحضانة. س: هل اختيار المضادات الحيوية ضروري للحفاظ على بلازميد MiniF-lacIq؟ ج: على الرغم من أن بلازميد MiniF يحمل جين مقاومة الكلورامفينيكول، إلا أن إضافة الكلورامفينيكول ليست ضرورية. في حال إضافته، يجب أن يكون تركيز الكلورامفينيكول النهائي 10 ميكروغرام/مل. إن مستويات الكلورامفينيكول التي تزيد عن 15 ميكروغرام/مل ستؤدي إلى إعاقة النمو.