نيو إنجلاند بيولابس، C3040I، NEB® بكتيريا الإشريكية القولونية المستقرة والمؤهلة (عالية الكفاءة)

الفئات ذات الصلة: الاستنساخ، سلالات الخلايا المؤهلة ، التطبيقات: حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، مواصفات التحويل، المضادات الحيوية لاختيار البلازميد ، تركيز العمل: أمبيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كاربينيسيلين 100 ميكروغرام/مل، كلورامفينيكول 33 ميكروغرام/مل، كاناميسين 30 ميكروغرام/مل، ملاحظات الشحن: يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة : س: ما هي سلالات الخلايا المؤهلة المتوافقة مع تقنية Gateway® Cloning؟ ج: يمكن استخدام سلالتي الإشريكية القولونية المؤهلتين NEB 5-alpha (NEB #C2987) وNEB 10-beta (NEB #C3019) مع تقنية Gateway Cloning. س: ما هي خصائص السلالة (C3040)؟ ج: الخصائص التي تساهم في فائدتها كسلالة استنساخ موضحة أدناه. تظهر الأنماط الجينية الكامنة وراء هذه الخصائص بين قوسين. الفحص الأزرق/الأبيض (Φ80 Δ(lacZ)M15): يُنتج جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز؛ بينما يحذف lacX74 جين بيتا-غالاكتوزيداز على الكروموسوم. يُشفّر البلازميد pUC19 والبلازميدات المشابهة الببتيد ألفا من بيتا-غالاكتوزيداز (lacZ). يمكن للببتيد ألفا أن يتحد مع جزء أوميغا من بيتا-غالاكتوزيداز المحمول على F' (تكميل ألفا). عند إعادة تكوين بيتا-غالاكتوزيداز بهذه الطريقة، يمكنه شطر X-gal، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء على طبق X-gal. تؤدي الإدخالات المستنسخة في منطقة الربط المتعددة للبلازميد إلى تعطيل جين الببتيد ألفا، فتكون المستعمرات بيضاء. نقص إعادة التركيب: (recA1) تمتلك الإشريكية القولونية نظام إصلاح يُعيد تركيب التسلسلات المتماثلة. غالبًا ما تحتوي النسخ الجينومية على مناطق مكررة، وقد تُسبب عمليات إعادة الترتيب التي يتوسطها جين recA مشاكل، خاصةً عندما تتجاوز مناطق التماثل 50 زوجًا قاعديًا. تميل السلالات التي حُذفت منها وظيفة recA إلى النمو ببطء أكبر من سلالات recA+. نقص الإندونوكلياز I (endA1): يحتوي الحيز المحيط بالبلازما في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري على إندونوكلياز غير متخصص. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تحلل البلازميدات المُحضرة من هذه الخلايا. تؤدي طفرة endA إلى حذف هذا الإندونوكلياز، ويمكنها تحسين جودة تحضيرات البلازميد بشكل ملحوظ. نقص التقييد [Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: تحمل سلالات الإشريكية القولونية K12 من النوع البري إنزيمًا داخليًا مقيدًا يقطع الحمض النووي في المواقع (AAC(N6)GTGC وGCAC(N6)GTT). بينما يكون الحمض النووي للإشريكية القولونية محميًا من التحلل بواسطة ناقل ميثيل خاص به، سيتم قطع الحمض النووي الغريب في هذه المواقع. يؤدي الحذف الموصوف أعلاه إلى إزالة كل من ناقل الميثيل والإنزيم الداخلي. نقص تقييد الميثيل [mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: تمتلك الإشريكية القولونية نظامًا من الإنزيمات، mcrA وmcrB وmrr، التي تقطع الحمض النووي بأنماط مثيلة موجودة في حقيقيات النوى العليا، بالإضافة إلى بعض السلالات النباتية والبكتيرية. لن يتم مثيلة الحمض النووي المشتق من شظايا PCR أو cDNA أو الحمض النووي الذي تم استنساخه مسبقًا في الإشريكية القولونية في هذه المواقع ولن يتم شطرها. تم تعطيل جميع إنزيمات Mcr الثلاثة في NEB 10-beta، مما يسمح بإدخال الحمض النووي حقيقي النواة ذي الأصل الجينومي (مثل المكتبات الأولية) إذا لزم الأمر. مقاومة العاثية T1 (fhuA): تتطلب العاثية T1، وهي عاثية شديدة الضراوة، مستقبل امتصاص هيدروكسامات الحديديك في الإشريكية القولونية لكي تكون معدية. يؤدي حذف هذا الجين إلى مقاومة هذا النوع من العاثيات، ولكنه لا يؤثر بشكل كبير على خصائص التحول أو النمو للخلية. التحكم في محفز اللاكتوز: (lacIq) يمنع مثبط اللاكتوز التعبير من محفزات lac وtac وtrc التي تحملها عادةً بلازميدات التعبير. إذا لم يكن مستوى مثبط اللاكتوز في خلايا الإشريكية القولونية كافيًا لتثبيط التعبير عبر هذه المحفزات أثناء التحول أو نمو الخلية، فإن حتى المستويات المنخفضة من التعبير يمكن أن تقلل من كفاءة التحول وتؤدي إلى استبعاد المتحولات المرغوبة. تساعد جزيئات مثبط اللاكتوز الإضافية في سلالات lacIq على تقليل نشاط المحفز إلى الحد الأدنى حتى تتم إضافة IPTG. س: ما هو ما هي مدة صلاحية هذه السلالة؟ ج: تاريخ انتهاء الصلاحية هو سنة واحدة من تاريخ التحليل المرفق مع المنتج. س: أي سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة يجب أن أستخدمها للاستنساخ العام؟ ج: بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) هي مشتق عالي الكفاءة من DH5α™، وهي سلالة الاستنساخ القياسية في الصناعة. تسمح بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984) وبكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha F´Iq (NEB #C2992) باستنساخ الجينات التي يحتمل أن تكون سامة نظرًا للتحكم الدقيق في التعبير بواسطة lacIq، وهما مناسبتان للفحص الأزرق/الأبيض. توفر بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Turbo (NEB #C2984) سرعة لا مثيل لها في عمليات التحويل، حيث تظهر المستعمرات المرئية بعد 6.5 ساعات فقط، ويمكن تحضير البلازميد بعد 4 ساعات. بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (NEB يُعدّ (#C3019) مشتقًا من DH10B™، ويمكن استخدامه لتحويل البلازميدات الكبيرة وBACs. يمكن استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية Dam-/dcm- المؤهلة (NEB #C2925) لنمو البلازميدات دون مثيلة. إذا تأثرت كفاءة الاستنساخ سلبًا بعناصر الحمض النووي المتكررة في الناقل أو تسلسل الإدخال، يُوصى باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable المؤهلة (NEB #C3040). (راجع بروتوكول استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على عناصر متكررة). هل أنت غير متأكد من سلالة الاستنساخ التي يجب اختيارها؟ تتيح لك عينة بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Cloning Competent (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. س: هل خلايا بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable المؤهلة مناسبة لتحويل البلازميدات الكبيرة ومنتجات NEBuilder HiFi أو Gibson Assembly أو Golden Gate Assembly الكبيرة؟ ج: نعم، يُوصى باستخدام بكتيريا NEB Stable المؤهلة كيميائيًا للبلازميدات الكبيرة ومنتجات NEBuilder الكبيرة منتجات HiFi وGibson وGolden Gate Assembly. س: كيف أحسب كفاءة التحويل (C3040)؟ ج: تُعرَّف كفاءة التحويل بأنها عدد وحدات تكوين المستعمرات (CFU) التي يمكن إنتاجها بتحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم معين من الخلايا المؤهلة. هذا المصطلح مُضلل نوعًا ما، إذ نادرًا ما يتم تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد فعليًا. بدلًا من ذلك، تُحسب الكفاءة عادةً بتحويل 100 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام من البلازميد فائق الالتفاف عالي النقاء في ظل ظروف مثالية. إذا كنت تخطط لحساب الكفاءة لمقارنة الخلايا أو عمليات الربط، فضع في اعتبارك المتغيرات العديدة التي تؤثر على هذا المقياس. معادلة كفاءة التحويل (TE): TE = عدد المستعمرات / ميكروغرام / التخفيف. عدد المستعمرات = عدد المستعمرات المحسوبة على الطبق. ميكروغرام = كمية الحمض النووي المُحوَّل مُعبَّرًا عنها بالميكروغرام. التخفيف = التخفيف الكلي للحمض النووي قبل الزرع. مثال على حساب TE: تحويل 2 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من عينة التحكم. يُضاف حمض pUC19 النووي إلى 50 ميكرولتر من الخلايا، ثم تُنمى بإضافة 250 ميكرولتر من وسط NEB 10-beta/Stable Outgrowth Medium، ويُخفف 10 ميكرولتر إلى 1 مل في نفس الوسط قبل زرع 30 ميكرولتر. إذا تم عدّ 150 مستعمرة على الطبق، فإن كفاءة التحويل (TE) هي: عدد المستعمرات = 150 ميكروغرام، تركيز الحمض النووي = 0.0001، التخفيف = 10/300 × 30/1000 = 0.001، كفاءة التحويل = 150/0.0001/0.001 = 1.5 × 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام. س: ما هي الصدمة الحرارية المثلى لهذه السلالة؟ (C3040) ج: الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تُعطي أعلى كفاءة تحويل لبكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable Competent. س: ما هو حجم الحمض النووي الذي يمكن س: هل يُضاف الحمض النووي إلى الخلايا المؤهلة؟ ج: يؤثر حجم الحمض النووي المُضاف إلى الخلايا المؤهلة على كفاءة التحويل. يُوصى باستخدام 1-5 ميكرولتر من الحمض النووي (بلازميد أو ناتج الربط) لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. في 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة، تنخفض كفاءة التحويل إلى 52% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 10 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 18% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). وتنخفض كفاءة التحويل إلى 5.2% عند زيادة حجم الحمض النووي إلى 50 ميكرولتر (من 2 ميكرولتر). س: هل يُعدّ NEB Stable مناسبًا لتحويل البلازميدات الأكبر حجمًا؟ ج: نعم. نجح NEB في تحويل بلازميد بحجم 24 كيلوبايت. عند تحويل كمية متساوية من جزيئات الحمض النووي، كانت كفاءة التحويل للبلازميد بحجم 24 كيلوبايت حوالي 80% مقارنةً بـ pUC19 (الذي يبلغ حجمه 2.7 كيلوبايت). (من حيث الحجم). س: هل يُعدّ NEB Stable بديلاً عن Stbl2 أو Stbl3؟ ج: نعم، يُوصى باستخدام NEB Stable في جميع تجارب الاستنساخ المعقدة. لا يرتبط النمط الجيني لـ NEB Stable بسلالتي الخلايا Stbl2 أو Stbl3، ولكن أداء NEB Stable متفوق. تم اختبار أداء السلالات الثلاث جميعها عن طريق استنساخ قطعة من الحمض النووي تحتوي على 5 تكرارات بطول 32 زوجًا قاعديًا. يُسمى التركيب المُختبَر pUC-5xREP، وقد تم إنشاؤه باستخدام طريقة جيبسون للتجميع في الاستنساخ. بعد تحويل تفاعل جيبسون للتجميع إلى السلالة المعنية، تم تحليل استقرار إدخال 5xREP بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرات: وصلت مستعمرات Stbl2 إلى قطر 1 مم في غضون 24 ساعة تقريبًا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. حملت جميع هذه المستعمرات نسخًا بلازميدية مع حذف (تم تحليل 33 من أصل 33 مستعمرة). وصلت مستعمرات Stbl3 إلى قطر 1 مم في غضون 18-20 ساعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. من بين 33 مستعمرة تم تحليلها، احتوت 22 مستعمرة على قطعة 5xREP كاملة الطول (67% صحيحة). تنمو خلايا NEB Stable جيدًا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية، ويتم الحصول على مستعمرات بقطر 1 مم بعد 18-20 ساعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. كانت استقرارية قطعة 5xREP في أفضل حالاتها عند استخدام NEB Stable كسلالة استنساخ (97% صحيحة، 32 من أصل 33 مستعمرة تم تحليلها). من المهم ذكره أن NEB Stable تحمل طفرة endA (على عكس Stbl3) بحيث تكون البلازميدات المعزولة خالية من الإندونوكلياز I. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي التي تم إنشاؤها باستخدام NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تركيبات الحمض النووي الناتجة متوافقة مع معظم خلايا E. coli المؤهلة. توصي NEB باستخدام NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كانت المنتجات المُجمَّعة أكبر من 15 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام NEB بكتيريا الإشريكية القولونية 10-بيتا المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية 10-بيتا المؤهلة كهربائيًا (NEB #C3020). إذا احتوت الجينات المُجمَّعة على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية 10-بيتا المستقرة المؤهلة (NEB #C3040). هل أنت غير متأكد من سلالة الاستنساخ التي يجب اختيارها؟ تتيح لك عينة بكتيريا الإشريكية القولونية 10-بيتا المؤهلة للاستنساخ (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 من سلالاتنا الكيميائية المؤهلة الشائعة. س: كيف يجب تخزين وسط النمو 10-بيتا/المستقر من NEB؟ ج: يمكن تخزين وسط النمو 10-بيتا/المستقر من NEB إما في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة حسب سرعة استخدامه. يُعد التخزين في درجة حرارة الغرفة مناسبًا وكافيًا للاستخدام قصير المدى (من أسابيع إلى شهرين). للتخزين طويل المدى، نوصي بالتخزين في درجة حرارة 4 درجات مئوية. س: هل هل تحتاج بكتيريا الإشريكية القولونية المستقرة والمؤهلة من NEB إلى فترة تعافي بعد التحويل باستخدام بلازميدات AmpR؟ ج: لا تتطلب تفاعلات التحويل باستخدام بلازميدات AmpR فترة تعافي بعد إضافة وسط التعافي. يتطلب اختيار البلازميد باستخدام مضادات حيوية أخرى غير الأمبيسيلين فترة تعافي لمدة 60 دقيقة عند 30 درجة مئوية قبل الزرع على أوساط انتقائية. يمكن استخدام 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية لحضانة الأطباق، ولكن يُوصى باستخدام 30 درجة مئوية لأن بعض التركيبات قد تكون غير مستقرة في درجات الحرارة المرتفعة. س: كيف يتم تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنظيف القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا تم استخدام الحمض النووي للبلازميد كقالب أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، فيمكن إزالته بمعالجة DpnI إذا لزم الأمر. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). إذا تعذر ذلك، يُنصح بتنقية الجل. قد يؤدي استخلاص الجل إلى إدخال غوانيدين ثيوسيانات (من محلول الإذابة) مما قد يقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الجل بحيث يمكن استخدام كمية أقل من محلول الإذابة. يمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام عمود الفصل. يمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع.