نيو إنجلاند بيولابس، E0540S، مجموعة O-جليكوسيداز و α2-3,6,8 نيورامينيداز

تحتوي هذه العبوة على قارورة واحدة من كل من O-Glycosidase ( الفئات ذات الصلة: إنزيمات التحلل الداخلي، التطبيقات: أنظمة التعبير، تسلسل الغليكان، هضم البروتين، المواصفات ، تعريف الوحدة: تُعرَّف وحدة واحدة من O-Glycosidase بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإزالة 0.68 نانومول من ثنائي السكاريد المرتبط بـ O من 5 ملغ من فيتوين غير مُشوه مُهضَّم بواسطة نيورامينيداز في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 100 ميكرولتر (ستزيل وحدة واحدة من كل من O-Glycosidase وPNGase F كميات مولية متساوية من ثنائي السكاريد المرتبط بـ O والسكريات قليلة التعدد المرتبطة بـ N، على التوالي). تعريف وحدة O-Glycosidase غير المُشوهة: تُضاف تخفيفات متسلسلة ثنائية الطي من O-Glycosidase إلى خليط تفاعل مكون من 5 ملغ من فيتوين مُهضَّم بواسطة نيورامينيداز مع 1X GlycoBuffer 2. يُحضن التفاعل بعد ذلك عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تُحدد الكربوهيدرات ثنائية السكاريد المرتبطة بالأكسجين باستخدام اختبار مورغان وإلسون (4). ملاحظة: في ظل ظروف التمسخ، يزداد نشاط الإنزيم بمقدار الضعف. وتعتمد هذه الملاحظة على الركيزة. تعريف وحدة النيورامينيداز: تُعرف وحدة واحدة من النيورامينيداز بأنها كمية الإنزيم اللازمة لفصل أكثر من 95% من α-Neu5Ac الطرفي من 1 نانومول من Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-7-أمينو-4-ميثيل-كومارين (AMC)، في 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. 1X محلول منظم لتمسخ البروتين السكري 0.5% SDS 40 ملي مولار DTT 1X NP-40 1% NP-40 في MilliQ-H 2 شروط التفاعل O: محلول غليكوبافر 2 بتركيز 1X، حضانة عند 37 درجة مئوية، محلول غليكوبافر 2 بتركيز 1X، فوسفات الصوديوم 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). الأسئلة الشائعة : س: ما هي شروط التفاعل النموذجية لإنزيم O-غليكوزيداز؟ ج: يجب تحديد أوقات الحضانة المثلى وتركيزات الإنزيم تجريبيًا لكل ركيزة. شروط التفاعل النموذجية هي كما يلي: امزج 10-20 ميكروغرام من البروتين السكري، و1 ميكرولتر من محلول غليكوبافر 2 بتركيز 10X، والماء (إذا لزم الأمر) للحصول على حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر. قم بتفكيك البروتين السكري عن طريق تسخين التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اجعل حجم التفاعل الإجمالي 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكرولتر من محلول غليكوبافر 2 بتركيز 10X، و2 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 10%. NP-40، 2 ميكرولتر من نيورامينيداز، ماء، و1-5 ميكرولتر من O-جليكوسيداز. حضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعات. ملاحظة: يمكن استخدام O-جليكوسيداز في ظروف التمسخ أو الظروف الطبيعية. مع ذلك، في ظروف التمسخ، يزداد نشاط الإنزيم بمقدار الضعف. هذه الملاحظة تعتمد على الركيزة. يمكن زيادة حجم التفاعل خطيًا لاستيعاب كميات كبيرة من O-جليكوسيداز وأحجام تفاعل أكبر. س: هل من الضروري معالجة البروتين السكري الخاص بي في وقت واحد باستخدام نيورامينيداز وO-جليكوسيداز؟ ج: نعم. يجب إزالة بقايا حمض النيورامينيك للسماح لـ O-جليكوسيداز بفصل ثنائيات السكاريد المرتبطة بـ O. يعمل نيورامينيداز عام (NEB #P0720) بشكل جيد. بالإضافة إلى ذلك، O-جليكوسيداز و مجموعة نيورامينيداز (NEB# E0540S) متوفرة. س: ما الفرق بين PNGase F و Endo H و O-Glycosidase؟ ج: يزيل PNGase F جميع أنواع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين (المرتبط بالأسباراجين)؛ بما في ذلك الغليكوزيل عالي المانوز، والغليكوزيل الهجين، والغليكوزيل ثنائي وثلاثي ورباعي التفرع. يُنصح باختيار هذا الإنزيم إذا كان الهدف هو إزالة جميع الكربوهيدرات المرتبطة بالنيتروجين بغض النظر عن نوعها. يزيل Endo H فقط الغليكوزيل عالي المانوز وبعض أنواع الغليكوزيل الهجينة المرتبطة بالنيتروجين. يُنصح باختيار هذا الإنزيم لتحديد نوع الغليكوزيل المرتبط بالنيتروجين بدقة أكبر، أو إذا كان البروتين يحتوي على كربوهيدرات حساسة لـ Endo H. يزيل O-Glycosidase من NEB ثنائيات السكاريد المرتبطة بالنيتروجين من النوعين الأساسيين 1 و 3 منزوعة حمض السياليك والمرتبطة ببقايا سيرين/ثريونين. س: ما كمية O-Glycosidase التي يجب استخدامها لإزالة الكربوهيدرات في الظروف الطبيعية؟ ج: عندما يكون البروتين قد يواجه إنزيم O-Glycosidase صعوبة في الوصول إلى موقع انقسام الكربوهيدرات (بسبب البنية الثانوية والثالثية للبروتين) إذا لم يتم تغيير طبيعته. في بعض الأحيان، قد يساعد استخدام إنزيم إضافي أو تمديد فترة الحضانة، ولكن هذه القيم خاصة بكل بروتين ويجب تحديدها تجريبيًا. س: كيف يمكنني تثبيط إنزيم O-Glycosidase؟ ج: يُثبط SDS إنزيم O-Glycosidase. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي الجيد لإنزيم O-Glycosidase؟ ج: نقترح استخدام p-Nitrophenyl galacto-N-bioside (Galβ1-3GalNAcα1pNP، أو Core1-pNP). بدلاً من ذلك، يمكن هضم الفيوتين (NEB #P6042S) باستخدام إنزيم النيورامينيداز، أو باستخدام إنزيم النيورامينيداز مع إنزيم O-Glycosidase. يمكن ملاحظة التغيرات في الوزن الجزيئي للفيوتين بعد إزالة السكريات باستخدام SDS-PAGE. س: لماذا نستخدم NEB هل تم تغيير محاليل التفاعل لإنزيمات الجليكوسيداز؟ ما هي محاليل التفاعل الجديدة، وهل لا يزال بإمكاني استخدام الإنزيم مع محلوله القديم؟ أين يمكنني العثور على تركيبة المحاليل القديمة؟ ج: لتبسيط إجراءات العمل والهضم باستخدام اثنين أو أكثر من إنزيمات الجليكوسيداز الخارجية، يتم الآن تزويد معظم الإنزيمات بمحلول GlycoBuffer 1 بتركيز 10X. ويُستثنى من ذلك إنزيمان مزودان بمحلول GlycoBuffer 4. كما تم تبسيط مجموعة محاليل التفاعل لإنزيمات الجليكوسيداز الداخلية. تم تقييم نشاط كل إنزيم من إنزيمات الجليكوسيداز الداخلية والخارجية في كل من نظام المحلول القديم والجديد. احتفظت جميع الإنزيمات إما بنفس النشاط، أو وُجد أن نشاطها أكبر في المحلول الجديد. لا تزال بعض إنزيمات الجليكوسيداز الخارجية مزودة بقارورة إضافية من rHSA (يعزز rHSA نشاط بعض الإنزيمات). وكما كان من قبل، لا تزال بعض إنزيمات الجليكوسيداز الخارجية مزودة بقارورة إضافية من BSA (يعزز BSA نشاط بعض الإنزيمات). المكونات الأخرى (مثل لا تزال محاليل إزالة طبيعة البروتينات السكرية (مثل NP-40) متوفرة عند الحاجة. رقم المنتج الإنزيمي | المحلول القديم | المحلول الحالي | هل تم التغيير؟ | α-N-أسيتيل جالاكتوزامينيداز | P0734 | G7 | GlycoBuffer 1 | نعم | α1-2 فوكوسيداز | P0724 | G4 | GlycoBuffer 1 | نعم | α1-2,3,4,6 فوكوسيداز | P0748 | --- | GlycoBuffer 1 | --- | α1-2,4,6 فوكوسيداز | O | p0749 | --- | GlycoBuffer 1 | --- | α1-3,4 فوكوسيداز | p0769 | --- | GlycoBuffer 1 | --- | α1-2,3 مانوسيداز | P0729 | G6 | GlycoBuffer 1 | لا | α1-6 مانوسيداز | P0727 | G2 | GlycoBuffer 1 نعم، مانوسيداز α1-2,3,6 p0768 --- جليكوبافر 4 --- جالاكتوزيداز α1-3,4,6 P0747 --- جليكوبافر 1 ---- جالاكتوزيداز α1-3,6 P0731 G6 جليكوبافر 1 لا، نيورامينيداز α2-3 S P0743 --- جليكوبافر 1 --- نيورامينيداز α2-3,6,8 P0720 G1 جليكوبافر 1 نعم، نيورامينيداز α2-3,6,8,9 A P0722 --- جليكوبافر 1 --- β-N-أسيتيل هيكسوزامينيداز P0721 G2 جليكوبافر 1 نعم، β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز P0732 G1 جليكوبافر 1 نعم β-N-أسيتيل جلوكوزامينيداز S P0744 --- جليكوبافر 1 --- β1-3 جالاكتوزيداز P0726 G6 جليكوبافر 1 لا β1-4 جالاكتوزيداز S P0745 --- جليكوبافر 1 --- β1-3,4 جالاكتوزيداز p0746 --- جليكوبافر 4 --- مجموعة تسلسل N-جليكان E0577 --- جليكوبافر 1 --- إندو S P0741 G6 جليكوبافر 1 نعم إندو H P0702 G5 جليكوبافر 3 نعم إندو Hf P0703 G5 جليكوبافر 3 نعم إندو F2 p0772 --- جليكوبافر 4 --- إندو F3 p0771 --- جليكوبافر 4 --- إندو D P0742 G7 GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase P0733 G7 GlycoBuffer 2 بدون O-Glycosidase وحزمة Neuraminidase E0540 G7 GlycoBuffer 2 بدون Remove-iT® PNGase F P0706 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F P0704 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين) P0705 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F، مُعاد التركيب P0708 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase F (خالي من الجلسرين)، مُعاد التركيب P0709 G7 GlycoBuffer 2 بدون PNGase A p0707 --- Glyco Buffer 3 --- مزيج إزالة الغليكوزيل من البروتين II p6044 --- مزيج إزالة الغليكوزيل Buffer 1 و2 --- Rapid PNGase F P0710 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F ---- إنزيم PNGase F السريع™ (صيغة غير مختزلة) p0711 --- محلول منظم سريع لإنزيم PNGase F (صيغة غير مختزلة) س: هل تُثبّط المنظفات إنزيم O-Glycosidase؟ ج: من الضروري إضافة NP-40 بتركيز نهائي 1% إلى خليط التفاعل لمواجهة تثبيط المنظفات. يتمتع إنزيم O-Glycosidase بنشاط كامل في وجود 1% من NP-40. س: حاولتُ استخدام إنزيم O-Glycosidase على البروتين السكري الخاص بي ولم ألاحظ إزالة الكربوهيدرات. ما المشكلة؟ ج: هل تعرف كيف ترتبط الكربوهيدرات بالبروتين؟ هل هي مرتبطة برابطة N أم O (مرتبطة بالأسباراجين، أو السيرين/الثريونين)؟ سيزيل إنزيم PNGase F الكربوهيدرات المرتبطة بالأسباراجين فقط. سيزيل إنزيم O-Glycosidase ثنائيات السكاريد المرتبطة برابطة O من النوع 1 والنوع 3 المرتبطة بالسيرين/الثريونين. إذا كنت للتأكد من وجود كربوهيدرات مرتبطة بروابط O، عالج البروتين السكري بإنزيم نيورامينيداز، وقم بتفكيك البروتين قبل إزالة السكريات. قد تمنع البنية الثانوية والثالثية للبروتينات إنزيمات إندوغليكوزيداز من الوصول إلى ركائزها، مما يجعل التفكيك خطوة حاسمة في عملية التحلل الفعالة. إذا كنت لا ترغب في التفكيك، ففكر في إضافة المزيد من الإنزيم وزيادة مدة الحضانة. أما إذا قمت بتفكيك البروتين، فتأكد من إضافة NP-40 (لحماية إنزيم O-غليكوزيداز من SDS في خطوة التفكيك).