نيو إنجلاند بيولابس، E0552S، مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع (بدون خلايا مؤهلة)

الفئات ذات الصلة: تركيب الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)، تجميع الحمض النووي، الاستنساخ، ومجموعات الطفرات. التطبيقات: الطفرات الموجهة للموقع، مواصفات الطفرات الموجهة للموقع . المواد المطلوبة (غير متوفرة ): خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة كيميائيًا، وسط نمو SOC، أطباق الاختيار. الأسئلة الشائعة : س: ما هو الحد الأقصى لعدد النيوكليوتيدات التي يمكن إدخالها باستخدام هذه المجموعة؟ ج: نظرًا لتصميم البادئات المتتالية، يمكن إدخال ما يصل إلى 100 نيوكليوتيد بشكل روتيني عن طريق إضافة ما يصل إلى 50 نيوكليوتيد إلى الطرف 5' لكل بادئ. يُرجى ملاحظة أنه يُوصى بتنقية أي بادئ يزيد طوله عن 60 نيوكليوتيد باستخدام HPLC أو PAGE. س: ما هي أقصى مسافة يمكن تحملها بين الاستبدالات؟ ج: نظرًا لتصميم البادئات المتتالية، يمكن إجراء الطفرات ضمن مسافة 100 نيوكليوتيد من بعضها البعض بشكل روتيني في خطوة واحدة. يُرجى ملاحظة أنه يُوصى بتنقية أي بادئ يزيد طوله عن 60 نيوكليوتيدًا باستخدام تقنية HPLC أو PAGE. س: ما هي النسبة المئوية للخلايا المُحوَّلة التي تحتوي عادةً على الطفرة المطلوبة؟ ج: نظرًا لدقة البوليميراز العالية وخطوة معالجة KLD القوية، فإن نسبة حدوث الطفرات المطلوبة عالية جدًا (أكثر من 90% في معظم التجارب). عند ملاحظة طفرات غير مرغوب فيها، فإنها عادةً ما تكون في موقع ربط البلازميد. س: ما هو مزيج KLD؟ ج: يحتوي مزيج KLD على مزيج من إنزيمات الكيناز والليغاز وDpnI في محلول منظم يحافظ على نشاط الإنزيمات. تسمح هذه التركيبة بالفسفرة الفعالة والربط/التكوير داخل الجزيء وإزالة القالب في خطوة تفاعل واحدة مدتها 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. س: ما أنواع الخلايا المؤهلة المتوافقة مع هذه المجموعة؟ أ: لقد ثبت أن خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة التالية تعمل مع هذه المجموعة: NEB #C2987، NEB 5-alpha (عالية الكفاءة) (التوصية القياسية)، NEB #C2992، NEB 5-alpha F´Iq (عالية الكفاءة)، NEB #C3019، NEB 10-beta (عالية الكفاءة)، NEB #C2984، NEB Turbo، NEB #C2566، T7 Express، NEB #C3029، Shuffle® T7. ولتسهيل الأمر، نوفر نسخة من مجموعة Q5 لتعديل المواقع الموجهة مُعبأة مسبقًا بخلايا الإشريكية القولونية المؤهلة C2987 NEB 5-alpha (عالية الكفاءة) في المنتج رقم E0554. يمكن استبدالها بسلالات أخرى من الإشريكية القولونية المؤهلة كيميائيًا والمناسبة للاستنساخ. ستختلف النتائج وفقًا لجودة وكفاءة الخلايا. الخلايا المؤهلة كهربائيًا غير متوافقة مع هذه المجموعة إلا إذا أُضيفت خطوة تنقية باستخدام عمود الطرد المركزي (استبدال المحلول المنظم بالماء) قبل التحويل. س: إذا ضاعفت حجم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، فهل يجب إضافة المزيد من مزيج تفاعل البلمرة المتسلسل إلى تفاعل KLD؟ ج: لا. صُمم مزيج إنزيم KLD بتركيز 10X ليعمل بكفاءة مع 1 ميكرولتر من مزيج تفاعل البلمرة المتسلسل بغض النظر عن حجم تفاعل البلمرة المتسلسل. س: لماذا الطفرة المطلوبة غائبة عن الخلايا المحولة التي فحصتها؟ ج: على الرغم من أن هذه ليست نتيجة شائعة، إلا أن هناك بعض الأسباب المعروفة لظهور الخلايا المحولة الخلفية: 1) وجود كمية زائدة من البلازميد في تفاعل البلمرة المتسلسل، 2) الانتقاء ضد تراكيب الحمض النووي المحددة مثل التكرارات المعكوسة أو المتتالية، و3) الانتقاء ضد البروتين المؤتلف بواسطة خلايا الإشريكية القولونية المضيفة. س: لماذا لا أرى ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل بعد استخدام مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: يُعد تصميم البادئات الصحيح وتحديد درجة حرارة التلدين أمرًا بالغ الأهمية. يُوصى بشدة باستخدام أداة تصميم البادئات للتطفير الموجه للموقع عبر الإنترنت من NEB، وهي NEBaseChanger، لتصميم البادئات وتحديد درجة حرارة التلدين. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن: 1) تركيز قالب البلازميد يتراوح بين 1 و25 نانوغرام، 2) تركيز البادئات النهائي 0.5 ميكرومولار، 3) زمن التمديد من 20 إلى 30 ثانية لكل كيلوبايت من البلازميد. س: ما هي أحجام البلازميدات التي يمكن تضخيمها باستخدام مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: لم نحدد بعد الحد الأقصى لحجم البلازميد. حتى الآن، تم تضخيم بلازميدات يصل حجمها إلى 20 كيلوبايت بنجاح. س: هل أحتاج إلى تنقية البلازميد قبل أو بعد تفاعل KLD عند استخدام مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: لا، التنقية غير ضرورية. س: كيف أصمم البادئات لاستخدامها مع مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، يُنصح بتصميم البادئات المتتالية باستخدام برنامج تصميم البادئات المتاح على الإنترنت على الرابط: NEBaseChanger.neb.com. للاطلاع على إرشادات تصميم البادئات العامة، اتبع التعليمات أدناه. تجدر الإشارة إلى أنه ليس من الضروري أن تكون كلتا البادئتين مُطفرة، كما لا يلزم فسفرتهما أو تنقيتهما. الاستبدالات: تُنشأ الاستبدالات عن طريق تصميم عدم تطابق في مركز البادئ المُطفر. يجب تضمين 10 نيوكليوتيدات على الأقل مُكملة للبلازميد الخاص بك عند الطرف 3' للبادئ. لاستيعاب الطفرات الكبيرة (من 7 إلى 50 لكل بادئ)، يجب دمج التغييرات عند الطرف 5' للبادئ المُطفر. سيبدأ الطرف 5' للبادئ الثاني من القاعدة المجاورة للطرف 5' للبادئ الأول، ويمتد في الاتجاه المعاكس على الشريط المُكمل. يمكن أن يكون هذا البادئ مُكملاً بنسبة 100% لتسلسل البلازميد، أو يمكن أن يحتوي على عدم تطابق، إذا لزم الأمر. يضمن غياب أي تداخل حدوث تضخيم أُسّي (بدلاً من التضخيم الخطي). الحذف: يتم إنشاء عمليات الحذف بتصميم بادئات تُحيط بجانبي المنطقة المراد حذفها. يجب تصميم البادئتين في اتجاهين متعاكسين بحيث تكون نهاياتهما 5' مُجاورة للمنطقة المراد حذفها. يمكن أن تكون البادئات مُكملة بنسبة 100% لتسلسل البلازميد، أو يمكن أن تحتوي على عدم تطابق و/أو إدخالات إذا لزم الأمر. الإدخال: يجب إضافة التسلسل المراد إدخاله إلى النهاية 5' للبادئ المُطَفِّر. بالنسبة للإدخالات التي يزيد طولها عن 6 نيوكليوتيدات، يمكن تقسيم تسلسل الإدخال بين البادئتين. يجب إضافة نصف الإدخال إلى النهاية 5' للبادئ الأمامي، والنصف الآخر إلى النهاية 5' للبادئ العكسي. كما هو موضح بالنسبة للاستبدالات، يجب أن يكون هناك 10 نيوكليوتيدات على الأقل مُكملة للبلازميد على النهاية 3' لكل بادئ. يُحدد الحد الأقصى لحجم الإدخال إلى حد كبير بقيود تصنيع الأوليغونوكليوتيدات. يمكن استيعاب إدخالات تصل إلى 100 نيوكليوتيد (50 نيوكليوتيد في الطرف 5' لكل بادئ) بشكل روتيني باستخدام هذه المجموعة. ملاحظة: بالنسبة للبادئات التي يزيد طولها عن 60 نيوكليوتيد، يُوصى بتنقيتها إما باستخدام HPLC أو PAGE. س: ما هي درجة حرارة التلدين التي يجب استخدامها مع مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: نوصي باستخدام أداة تصميم البادئات عبر الإنترنت من NEB، NEBaseChanger، لتوفير درجة حرارة تلدين مُحسَّنة لأزواج البادئات المُطفرة. بالنسبة لمجموعات البادئات المُصممة مسبقًا والمُتصلة ببعضها البعض، يمكن تطبيق قاعدة Tm+3، ولكن قد يكون التحسين ضروريًا. يُرجى ملاحظة أن عدم تطابق البادئ المُطَفِّر لا يُؤخذ في الحسبان عند استخدام حسابات Tm القياسية، وقد تختلف درجة حرارة التلدين المُثلى لإنزيم Q5 High Fidelity Hot Start DNA Polymerase اختلافًا كبيرًا عن درجة حرارة التلدين لإنزيمات Taq. بالنسبة لأزواج البادئات ذات درجات حرارة التلدين القريبة من 72 درجة مئوية، يُمكن استخدام بروتوكول دورات ثنائي الخطوات دون خطوة تلدين منفصلة. س: أستخدم مجموعة Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit لإدخال طفرات مفردة. كيف يُمكنني إدخال طفرات متعددة؟ ج: طورت شركة NEB® بروتوكولًا باستخدام NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتبسيط عملية بناء الطفرات الموجهة متعددة المواقع. تتضمن هذه التقنية تصميم بادئات مُكمِّلة مُجاورة لمحاذاة القطع. تُوضح هذه المذكرة التطبيقية استخدام NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتوليد طفرات موجهة متعددة المواقع في الوقت نفسه. نوصي بتداخلات تتراوح بين 18 و20 نيوكليوتيدًا، ولكن يُمكن أن يختلف طول البادئات. تتداخل البادئات تمامًا كما هو موضح أدناه. الهدف هو تحقيق توازن في قيم Ta لأزواج البادئات. تقع الطفرات في منتصف البادئة. يجب أن يكون هناك عدد كافٍ من القواعد على كلا الجانبين، والأهم من ذلك، في الطرف 3' من الطفرة، حتى ترتبط البادئة بشكل صحيح بالقالب. س: هل يوجد راسب في قاع أنبوب المزيج الرئيسي؟ هل هذا طبيعي؟ ج: قد يترسب المزيج الرئيسي Q5® عند التجميد والذوبان. هذا لا يشير إلى وجود مشكلة في المنتج. للحصول على أفضل أداء، قم بإذابة المنتج تمامًا وأعد تعليق أي راسب عن طريق تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة وقلبه برفق حتى يذوب تمامًا. س: هل يمكنني إجراء استخلاص هلامي إذا كان ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يحتوي على عدة نطاقات؟ ج: نعم. إذا نتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم خارج الهدف، فمن الأفضل تحسين التفاعل قدر الإمكان. إذا تعذر تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل، نوصي بإجراء استخلاص هلامي باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي من هلام Monarch® Spin (NEB #T1120). يمكن إدخال ما يصل إلى 4 ميكرولتر من الحمض النووي النقي في تفاعل KLD. للحصول على مساعدة في تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، راجع هذه الإرشادات: https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-thermophilic-dna-polymerases