مجموعة نيو إنجلاند بيولابس، E0554S، Q5® للتطفير الموجه للموقع

الفئات ذات الصلة بـ Q5: تركيب الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)، تجميع الحمض النووي، الاستنساخ، ومجموعات الطفرات الموجهة. التطبيقات: الطفرات الموجهة للموقع، أسئلة وأجوبة حول الطفرات الموجهة للموقع. س: كيف أصمم البادئات لاستخدامها مع مجموعة Q5® للطفرات الموجهة للموقع؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، يُنصح بتصميم البادئات المتتالية باستخدام برنامج تصميم البادئات المتاح عبر الإنترنت على الرابط: NEBaseChanger.neb.com. للاطلاع على إرشادات تصميم البادئات العامة، اتبع التعليمات أدناه. لاحظ أنه ليس من الضروري أن تكون كلتا البادئتين مُطفرة، ولا يلزم فسفرتهما أو تنقيتهما. الاستبدالات: تُنشأ الاستبدالات عن طريق تصميم عدم تطابق في مركز البادئ المُطفر. يجب تضمين 10 نيوكليوتيدات على الأقل مُكملة للبلازميد الخاص بك في الطرف 3' من البادئ. لاستيعاب الطفرات الكبيرة (من 7 إلى 50 لكل بادئ)، يجب دمج التغييرات في الطرف 5' من البادئ المُطفر. يبدأ الطرف 5' للبادئ الثاني من القاعدة المجاورة للطرف 5' للبادئ الأول، ويمتد في الاتجاه المعاكس على السلسلة المكملة. يمكن أن يكون هذا البادئ مكملاً بنسبة 100% لتسلسل البلازميد، أو يمكن أن يحتوي على عدم تطابق، إذا لزم الأمر. يضمن عدم وجود أي تداخل حدوث تضخيم أُسّي (بدلاً من التضخيم الخطي). الحذف: يتم إنشاء عمليات الحذف بتصميم بوادئ تُحيط بجانبي المنطقة المراد حذفها. يجب تصميم البادئين في اتجاهين متعاكسين، بحيث يكون طرفاهما 5' مجاورين للمنطقة المراد حذفها. يمكن أن يكون البادئان مكملين بنسبة 100% لتسلسل البلازميد، أو يمكن أن يحتويا على عدم تطابق و/أو إدخالات، إذا لزم الأمر. الإدخال: يجب إضافة التسلسل المراد إدخاله إلى الطرف 5' للبادئ المُطَفِّر. بالنسبة للإدخالات التي يزيد طولها عن 6 نيوكليوتيدات، يمكن تقسيم تسلسل الإدخال بين البادئين. يُضاف نصف القطعة المُدخلة إلى الطرف 5' من البادئ الأمامي، ويُضاف النصف الآخر إلى الطرف 5' من البادئ العكسي. وكما هو موضح في قسم الاستبدالات، يجب أن يكون هناك 10 نيوكليوتيدات على الأقل مُكملة للبلازميد الخاص بك على الطرف 3' من كل بادئ. ويُحدد الحد الأقصى لحجم القطعة المُدخلة إلى حد كبير بقيود تصنيع الأوليغونوكليوتيدات. ويمكن استيعاب قطع مُدخلة يصل طولها إلى 100 نيوكليوتيد (50 نيوكليوتيدًا عند الطرف 5' من كل بادئ) بشكل روتيني باستخدام هذه المجموعة. ملاحظة: بالنسبة للبادئات التي يزيد طولها عن 60 نيوكليوتيدًا، يُوصى بتنقيتها باستخدام HPLC أو PAGE. س: ما هي درجة حرارة التلدين المُناسبة لمجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: نوصي باستخدام أداة تصميم البادئات عبر الإنترنت من NEB، NEBaseChanger، لتوفير درجة حرارة تلدين مُثلى لأزواج البادئات المُطفرة. بالنسبة لمجموعات البادئات المتتالية المصممة مسبقًا، يمكن تطبيق قاعدة Tm+3، ولكن قد يلزم إجراء تحسين. تجدر الإشارة إلى أن حسابات Tm القياسية لا تأخذ في الحسبان حالات عدم التطابق في البادئ المُطَفِّر، وقد تختلف درجة حرارة التلدين المثلى لإنزيم Q5 High Fidelity Hot Start DNA Polymerase اختلافًا كبيرًا عن درجة حرارة التلدين لإنزيمات Taq. بالنسبة لأزواج البادئات ذات درجات حرارة التلدين القريبة من 72 درجة مئوية، يمكن استخدام بروتوكول دورات من خطوتين دون خطوة تلدين منفصلة. س: هل أحتاج إلى تنقية البلازميد قبل أو بعد تفاعل KLD عند استخدام مجموعة Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit؟ ج: لا، التنقية غير ضرورية. س: ما هي أحجام البلازميدات التي يمكن تضخيمها باستخدام مجموعة Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit؟ ج: لم نحدد بعد الحد الأقصى لحجم البلازميد. حتى الآن، تم تضخيم بلازميدات يصل حجمها إلى 20 كيلوبايت بنجاح. س: ما هو الحد الأقصى لعدد النيوكليوتيدات التي يمكن إدخالها باستخدام هذه المجموعة؟ ج: نظرًا لتصميم البادئات المتتالية، يمكن إدخال ما يصل إلى 100 نيوكليوتيد بشكل روتيني عن طريق إضافة ما يصل إلى 50 نيوكليوتيد إلى الطرف 5' لكل بادئ. يُرجى ملاحظة أنه يُوصى بتنقية أي بادئ يزيد طوله عن 60 نيوكليوتيد باستخدام HPLC أو PAGE. س: ما هي أقصى مسافة يمكن تحملها بين الاستبدالات؟ ج: نظرًا لتصميم البادئات المتتالية، يمكن إجراء الطفرات ضمن مسافة 100 نيوكليوتيد من بعضها البعض بشكل روتيني في خطوة واحدة. يُرجى ملاحظة أنه يُوصى بتنقية أي بادئ يزيد طوله عن 60 نيوكليوتيد باستخدام HPLC أو PAGE. س: ما هي النسبة المئوية للمتحولات التي تحتوي عادةً على الطفرة المطلوبة؟ ج: نظرًا لدقة البوليميراز العالية وخطوة معالجة KLD القوية، فإن معدل حدوث الطفرات المطلوبة مرتفع جدًا (>90% في معظم التجارب). عند ملاحظة طفرات غير مرغوب فيها، فإنها عادةً ما تحدث في موقع ربط البلازميد. س: ما هو مزيج KLD؟ ج: يحتوي مزيج KLD على مزيج من إنزيمات الكيناز والليغاز وDpnI في محلول منظم يحافظ على نشاط الإنزيمات. تسمح هذه التركيبة بالفسفرة الفعالة، والربط/التكوير داخل الجزيء، وإزالة القالب في خطوة تفاعل واحدة مدتها 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. س: هل يمكنني استخدام خلاياي المؤهلة؟ ج: نعم. على الرغم من أن مجموعة Q5® لتعديل المواقع الموجهة ستعمل على النحو الأمثل مع بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة عالية الكفاءة من NEB المرفقة، إلا أنه يمكن استبدالها بسلالات أخرى من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة كيميائيًا والمناسبة للاستنساخ. ستختلف النتائج وفقًا لجودة وكفاءة الخلايا. س: إذا ضاعفت حجم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، فهل يجب عليّ إضافة المزيد من مزيج PCR إلى تفاعل KLD؟ ج: لا. تم تصميم مزيج إنزيم KLD بتركيز 10X ليعمل بكفاءة مع 1 ميكرولتر من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بغض النظر عن حجم التفاعل. س: لماذا الطفرة المطلوبة غير موجودة في الخلايا المحولة التي فحصتها؟ ج: على الرغم من أن هذه ليست نتيجة شائعة، إلا أن هناك بعض الأسباب المعروفة لظهور الخلايا المحولة غير المرغوب فيها: 1) وجود كمية زائدة من البلازميد في تفاعل البوليميراز المتسلسل، 2) الانتقاء ضد تراكيب الحمض النووي المحددة مثل التكرارات المعكوسة أو المتتالية، و3) الانتقاء ضد البروتين المؤتلف بواسطة خلايا الإشريكية القولونية المضيفة. س: لماذا لا أرى ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد استخدام مجموعة Q5® للتطفير الموجه للموقع؟ ج: يُعد تصميم البادئات الصحيح وتحديد درجة حرارة التلدين أمرًا بالغ الأهمية. يُنصح بشدة باستخدام أداة تصميم البادئات للتطفير الموجه للموقع عبر الإنترنت من NEB، NEBaseChanger، لتصميم البادئات وتحديد درجة حرارة التلدين. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن: 1) تركيز قالب البلازميد يتراوح بين 1 و25 نانوغرام، 2) تركيز البادئ النهائي 0.5 ميكرومولار، 3) زمن التمديد 20-30 ثانية لكل كيلوبايت من البلازميد. س: أستخدم مجموعة Q5 للتطفير الموجه للموقع لإدخال طفرات مفردة. كيف يمكنني إدخال طفرات متعددة؟ ج: طورت شركة NEB® بروتوكولًا باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتبسيط عملية بناء الطفرات الموجهة للموقع المتعددة. تتضمن هذه التقنية تصميم بادئات جانبية متكاملة لمحاذاة القطع. تشرح هذه المذكرة التطبيقية استخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتوليد طفرات موجهة للموقع متعددة في الوقت نفسه. نوصي بتداخلات تتراوح بين 18 و20 نيوكليوتيد، ولكن يمكن أن يختلف طول البادئات. تتداخل البادئات تمامًا كما هو موضح أدناه. الهدف هو تحقيق توازن في قيم Ta لأزواج البادئات. تتوضع الطفرات في منتصف البادئ. يجب أن يكون هناك عدد كافٍ من القواعد على كلا الجانبين، والأهم من ذلك، في الطرف 3' من الطفرة، حتى يرتبط البادئ بشكل صحيح بالقالب. س: هل يوجد راسب في قاع أنبوب المزيج الرئيسي؟ هل هذا طبيعي؟ ج: قد يترسب المزيج الرئيسي Q5® عند التجميد والإذابة. هذا لا يشير إلى وجود مشكلة في المنتج. للحصول على أفضل أداء، قم بإذابة المنتج تمامًا وأعد تعليق أي راسب عن طريق تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة وقلبه برفق حتى يذوب تمامًا. س: هل يمكنني إجراء استخلاص هلامي إذا كان ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يحتوي على عدة نطاقات؟ ج: نعم. إذا نتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم خارج الهدف، فمن الأفضل تحسين التفاعل قدر الإمكان. إذا تعذر تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل، نوصي بإجراء استخلاص هلامي باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي من هلام Monarch® Spin (NEB #T1120). يمكن نقل ما يصل إلى 4 ميكرولتر من الحمض النووي النقي إلى تفاعل KLD. للحصول على مساعدة في تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، راجع هذه الإرشادات: https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-thermophilic-dna-polymerases