مجموعة التعبير البروتيني لبكتيريا K. lactis من شركة New England Biolabs، طراز E1000S.

الفئات ذات الصلة: التعبير عن البروتين في الخميرة، تطبيقات التعبير عن البروتين، مواصفات التعبير عن البروتين، ملاحظات الشحن: يُشحن على ثلج جاف، الأسئلة الشائعة: س: ما هي الأنظمة التي تقدمها NEB للتعبير عن البروتين وتنقيته؟ ج: يستفيد نظام NEBExpress® MBP Fusion and Purification System (NEB# E8201) من مُحفز Ptac القوي وإشارات بدء الترجمة لبروتين ربط المالتوز (MBP) لتعزيز ذوبان ومستويات التعبير عن البروتين المطلوب في بكتيريا الإشريكية القولونية. والمنتج الناتج هو بروتين اندماجي MBP، والذي يتم تنقيته وعزله في خطوتين سهلتين: الإذابة بالأميلوز متبوعةً بالتحلل بواسطة بروتياز TEV والعزل باستخدام راتنج النيكل، مما ينتج عنه بروتين مستهدف عالي النقاء وخالٍ من العلامات. يستخدم نظام IMPACT™ (NEB# E6901) عناصر ربط البروتين المُهندسة (الإنتينات) لتنقية البروتينات المُعاد تركيبها بواسطة عمود تقارب الكيتين واحد. يتميز هذا النظام عن أنظمة دمج البروتينات الأخرى بقدرته على فصل البروتين المُعاد تركيبه عن علامة التقارب دون استخدام إنزيم البروتياز. إضافةً إلى ذلك، يُمكن عزل البروتينات المُعاد تركيبها الأصلية التي تحتوي على ثيوإستر في الطرف الكربوكسيلي لتطبيقات مثل التخليق الجزئي للبروتينات ووسم المواقع المحددة. توفر مجموعة K.lactis Protein Expression Kit (NEB# E1000) طريقة سهلة للتعبير عن جين مُحدد في خميرة Kluyveromyces lactis. يُمكن إنتاج البروتينات داخل الخلايا أو إفرازها باستخدام ناقل التعبير التكاملي pKLAC1 المُرفق. أما مجموعة PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB# E6800) فهي نظام نسخ/ترجمة خالٍ من الخلايا من بكتيريا E. coli، مُعاد تكوينه من مكونات مُنقّاة. عوامل النسخ/الترجمة في بكتيريا E. coli (باستثناء الريبوسومات) مُوسومة بالهيستيدين. يُمكن التعبير عن البروتين المستهدف من قوالب الحمض النووي الخطي أو البلازميدي التي تحتوي على مُحفز T7. نظام NEBExpress™ لتخليق البروتين من بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا (NEB #E5360) هو نظام قائم على المستخلصات مشتق من خلايا الإشريكية القولونية، تم هندسته لإنتاج كميات كبيرة من البروتين المؤتلف في المختبر من جينات مستنسخة أسفل محفز T7 في قوالب الحمض النووي الخطي أو البلازميدي. يمكن عزل البروتين المستهدف المؤتلف بكفاءة باستخدام خرزات NEBExpress Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423)، أو أعمدة الطرد المركزي (NEB #S1427)، أو الراتنج (NEB #S1428). خرزات NEBExpress™ Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423)، وأعمدة NEBExpress™ Ni الدوارة (NEB #S1427)، وراتنج NEBExpress™ Ni (NEB #S1428) - مجموعة من منتجات النيكل المثبتة لعزل البروتينات الموسومة بالهيستيدين المتعدد (His-tagged) من مستخلصات الخلايا أو تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. س: استلمتُ مجموعتي ولا أرى أي خلايا مؤهلة أو كاشف تحويل. أين هما؟ ج: تُعبأ الخلايا المؤهلة وكاشف التحويل معًا (NEB #C1001S) ويتم شحنهما بشكل منفصل عن علبة المجموعة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. يُرجى تخزين الخلايا المؤهلة فورًا عند درجة حرارة -80 درجة مئوية عند وصولها. يمكن تخزين كاشف التحويل عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزًا للاستخدام، ولكن بمجرد إذابته، يجب أن يبقى عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ولا يُعاد تجميده. يجب تخزين علبة المجموعة (E1000S) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: لقد قمتُ بتعبير البروتين، كيف أقوم بتنقيته الآن؟ ج: ننصح العملاء بتحديد ذلك قبل البدء باستخدام المجموعة. لا يُنصح بوسم البروتينات المُفرزة بتسلسلات متعددة الهيستيدين في الطرف الكربوكسيلي أو الأميني. في معظم الحالات المُبلغ عنها، لن ترتبط البروتينات التي تحمل وسمًا من ستة أو عشرة بقايا هيستيدين بكفاءة بأعمدة النيكل، ويصعب الكشف عنها بواسطة تحليل ويسترن باستخدام الأجسام المضادة لوسم الهيستيدين. يمكن استخدام راتنجات التنقية التقليدية، مثل راتنجات التبادل الأيوني والراتنجات الكارهة للماء. س: لاحظتُ أن بكتيريا K. lactis غير المُحوَّرة تنمو عند زرعها على وسط الانتقاء. هل الانتقاء غير فعال؟ ج: تحتوي بكتيريا K. lactis على إنزيم أسيتاميداز طبيعي ضعيف النشاط، مما يسمح بنمو ضئيل للخلايا غير المُحوَّرة على وسط الانتقاء. عند نجاح التحويل، يتجاوز نمو الخلايا المُحوَّرة بشكل صحيح هذا النمو الأساسي بسرعة، حيث تُشكِّل مستعمرات كبيرة بقطر 1-2 مم. أظهرت هذه المستعمرات نتائج إيجابية بنسبة تقارب 100% في دمج الكاسيت. س: أين يمكنني العثور على أسئلة وأجوبة أكثر تفصيلاً حول مجموعة التعبير عن البروتين لـ K. lactis؟ ج: يمكنك العثور على قائمة كاملة بالأسئلة والأجوبة حول التعبير عن البروتين لـ K. lactis هنا. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المؤتلف. ونعتقد أن الابتعاد عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.