مجموعة كويك بلانتينج™ من نيو إنجلاند بيولابس، E1201L

تُستخدم مجموعة Quick Blunting™ لتحويل الحمض النووي ذي النهايات غير المتوافقة 5' أو 3' إلى حمض نووي مُفسفر 5' ذي نهايات غير لاصقة، وذلك لربط النهايات غير اللاصقة بكفاءة في نواقل استنساخ الحمض النووي. الفئات ذات الصلة: تطبيقات معالجة الحمض النووي، إزالة النهايات غير اللاصقة، الفسفرة (كيناز)، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الأسئلة الشائعة : س: ما هو الليغاز الموصى به لربط الحمض النووي المعالج بمجموعة Quick Blunting؟ ج: يُوصى باستخدام مجموعة NEB Quick Ligation Kit NEB #M2200. س: هل يُمكنني استخدام الليغاز العادي لربط ناتجي المُزال منه النهايات غير اللاصقة؟ ج: نعم، ولكن يجب حضانة تفاعل الربط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يُلاحظ انخفاض كبير في كفاءة التحويل مع تقليل مدة الحضانة. س: لقد قمتُ بإزالة النهايات غير اللاصقة من الحمض النووي الخاص بي، وأحتاج الآن إلى إزالة الفسفرة من التفاعل باستخدام فوسفاتاز القطب الجنوبي. هل أحتاج إلى تنقية التفاعل؟ ج: نعم، يجب تنقية التفاعل قبل إزالة الفوسفات باستخدام فوسفاتاز القطب الجنوبي، أو CIP، أو أي فوسفاتاز آخر متوفر تجاريًا. يمكن تنقية التفاعل باستخدام مجموعة تنقية تجارية، أو استخلاص الفينول/الترسيب بالإيثانول، أو الفصل الكهربائي الهلامي. س: هل يجب تنقية ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قبل إزالة التداخل باستخدام مجموعة Quick Blunting Kit؟ ما هي الطرق التي يمكن استخدامها لتنقية الناتج؟ ج: نعم، يجب تنقية تفاعلات PCR قبل إزالة التداخل؛ نوصي باستخدام مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup Kit. س: لقد قمت بهضم الحمض النووي الخاص بي وأريد الآن إزالة التداخل مباشرةً دون تنقية، هل يمكنني إضافة كواشف إزالة التداخل مباشرةً إلى ناتج الهضم الإنزيمي؟ ج: نوصي بتعطيل الإنزيم المقيد بالحرارة بعد الهضم الإنزيمي وقبل تفاعل إزالة التداخل. إذا تم إجراء عملية الهضم باستخدام إنزيمات قابلة للتثبيط بالمعالجة الحرارية، فبعد خطوة التثبيط الحراري، أضف 0.1 حجم من dNTPs و1 ميكرولتر من إنزيم التثبيط، ثم حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أما إذا كانت إنزيمات التقييد المستخدمة غير قابلة للتثبيط بالمعالجة الحرارية، فسيلزم تنقية التفاعل باستخدام مجموعة تنقية تجارية (نوصي بمجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup Kit)، أو إجراء التفاعل على هلام الأغاروز ثم استخلاص الحمض النووي (نوصي بمجموعة Monarch Gel Extraction Kit)، أو إجراء استخلاص باستخدام الفينول/الكلوروفورم. س: قمت بتثبيط نهايات الحمض النووي الجينومي المُعالج بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة بدلاً من مدة التحضين الموصى بها وهي 30 دقيقة، فهل سينجح التفاعل؟ ج: تُلاحظ كفاءة تحويل أقل قليلاً مع فترات التحضين الأقصر، ولكن سيظل التفاعل ناجحًا. بشكل عام، يقل عدد الخلايا المتحولة بمقدار 1.5 مرة عند حضانة ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) أو الحمض النووي المقطّع/المُرَذَّذ لمدة 15 دقيقة بدلاً من 30 دقيقة. إذا رغبتَ في حضانة لمدة 15 دقيقة، فقم بزيادة حجم مزيج إزالة التداخل إلى 2 ميكرولتر في التفاعل. س: لقد تخطيتُ عن طريق الخطأ خطوة التعقيم الحراري بعد تفاعل إزالة التداخل. هل سينجح الربط؟ ج: نعم، ولكن قد يكون هناك مستوى أعلى من الإشارة الخلفية لأن إنزيم كيناز عديد النوكليوتيد سيظل نشطًا وقادرًا على فسفرة الناقل.