نيو إنجلاند بيولابس، E1203S، مجموعة استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل NEB® (بدون خلايا مؤهلة)

سهولة استنساخ جميع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بما في ذلك النهايات غير المتداخلة ونهايات TA. الفئات ذات الصلة: مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات. الأسئلة الشائعة : س: كيف تعمل مجموعة استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل NEB®؟ ج: يصعب على بكتيريا الإشريكية القولونية معالجة الأطر المفتوحة للقراءة التي تشفر 5 أحماض أمينية أو أقل (2، 3). تؤدي هذه الجينات الصغيرة، أو الجينات المصغرة، إلى إطلاق مبكر للببتيد الصغير جدًا من الريبوسوم، مع بقاء آخر حمض أميني مرتبطًا تساهميًا بجزيء الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA)، بحيث لا يكون tRNA متاحًا بسهولة لتخليق البروتين. إذا أعاد ناقل pMiniT 2.0 تدوير نفسه بدون إدخال، فسيؤدي ذلك إلى تثبيط مميت لتخليق البروتين ولن تتكون مستعمرة. أما إذا كان ناقل pMiniT 2.0 يحمل إدخالًا، فستنمو مستعمرة. س: كيف يمكن لناقل الاستنساخ العمل مع كل من المضخمات ذات النهايات غير المتداخلة والمضخمات التي تحتوي على قاعدة واحدة بارزة؟ ج: تحتوي الخلطات على مكونات لتلميع النهايات، والتي تحوّل النهايات المتدلية أحادية القاعدة، مثل تلك الموجودة في منتجات التضخيم المُصنّعة بواسطة بوليميراز الحمض النووي Taq أو الخلطات القائمة على Taq، إلى نهايات غير لاصقة. بعد ذلك، يمكن ربط شكل النهاية غير اللاصقة في ناقل pMiniT 2.0. س: هل تؤثر مكونات التلميع الموجودة في الخلطة الرئيسية على كفاءة الاستنساخ إذا كانت القطعة المُدخلة تحتوي بالفعل على نهايات غير لاصقة؟ ج: لا. تم تحسين تركيزات مكونات تلميع النهايات بعناية لإزالة أي نهايات متدلية أحادية القاعدة وتكوين نهايات غير لاصقة؛ ولا تتأثر منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات النهايات غير اللاصقة. س: هل يجب أن تحتوي القطع المُدخلة على مجموعات فوسفات في الطرف 5'؟ ج: لا، تعمل استراتيجية الاستنساخ هذه بشكل جيد مع القطع المُدخلة سواءً احتوت على مجموعات فوسفات في الطرف 5' أم لا. في الواقع، استخدام بادئات غير مُفسفرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يمنع إمكانية استنساخ قطع مُدخلة متعددة في ناقل pMiniT 2.0. س: هل يمكن استخدام مجموعة الاستنساخ لإدخالات ليست بالضرورة ناتجة عن تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: نعم، تعمل المجموعة بكفاءة متساوية مع قطع التقييد ذات النهايات غير المتداخلة وقطع التقييد ذات القاعدة الواحدة المتدلية، أو مع الحمض النووي الاصطناعي. س: هل يمكن استخدام مجموعة الاستنساخ مع إدخالات تحتوي على امتدادات 5' أو 3' أطول من امتداد القاعدة الواحدة الناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميراز Taq DNA؟ ج: نعم، ولكن بكفاءة أقل. تم تحسين مكونات التلميع لإزالة امتداد القاعدة الواحدة. كمثال اختباري متطرف، أدى استنساخ قطعة DNA تحتوي على امتداد 5' بطول 4 قواعد يتطلب ملء، وامتداد 3' بطول 5 قواعد يتطلب إعادة تشكيل، إلى عدد أقل بعشر مرات من المتحولات مقارنةً بقطع DNA ذات النهايات غير المتداخلة أو ذات امتداد القاعدة الواحدة. س: هل يمكنني استخدام مجموعة استنساخ NEB PCR التي تحتوي على pMiniT 2.0 لتجميع Golden Gate؟ ج: لا يحتوي pMiniT 2.0 على مواقع BsaI، لذا يمكن استخدامه لاستنساخ وحدات Golden Gate التي تحتوي على مواقع BsaI. س: هل يلزم تنقية ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: لا، على الرغم من أن كفاءة التحويل تتحقق باستخدام قطع مُدخلة مُنقّاة. في حال استخدام قطع PCR غير مُنقّاة، استخدم 1 ميكرولتر أو أقل من ناتج PCR كمادة مُدخلة لتحقيق نسبة مولية 3:1 بين القطعة المُدخلة والناقل. من المهم بشكل خاص في حالات تفاعل PCR عالي الإنتاجية تجنب إضافة كمية زائدة من القطعة المُدخلة، لأن ذلك سيؤدي إلى ربطها بكلا طرفي هيكل الناقل. س: هل يمكنني استخدام سلالة E. coli مُؤهلة مختلفة عن سلالة NEB 10-beta المُرفقة؟ ج: على الرغم من أن نظام الاستنساخ هذا يعمل بشكل جيد مع مجموعة متنوعة من سلالات الخلايا، فمن المهم استخدام سلالة خلايا ذات نمو قوي للحفاظ على ضغط الانتقاء تجاه تركيبات البلازميد التي تحتوي على القطعة المُدخلة. بالإضافة إلى بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (كفاءة الاستنساخ) المرفقة في مجموعة استنساخ تفاعل البوليميراز المتسلسل NEB (NEB #E1202)، تشمل سلالات الخلايا التي تعمل بشكل جيد مع هذه المجموعة سلالتي NEB Turbo (NEB #C2984) وNEBExpress (NEB #C2523) من الإشريكية القولونية المؤهلة. لا يُنصح باستخدام سلالات 5-alpha، لأن معدل نموها الأبطأ قليلاً لا يدعم كبحًا قويًا للخلفية. س: كيف يمكنني زيادة عدد الخلايا المحولة إلى أقصى حد؟ ج: استخدم الفترات الزمنية الأطول المقترحة لخطوات البروتوكول. إذا رغبت، يمكنك زرع 50 ميكرولتر إضافية من 1 مل من النمو على أطباق إضافية، ولكن لا تزرع أكثر من 50 ميكرولتر لكل طبق للحفاظ على خلفية منخفضة. س: هل يمكنني تقليل حجم التفاعلات لاستخدام كمية أقل من الناقل؟ ج: يمكن تقليل كمية الناقل المستخدمة لكل تفاعل من 25 نانوغرام إلى 10 نانوغرام. قلل كمية المُدخل بشكل متناسب للحفاظ على النسبة المولية المثلى 3:1 بين المُدخل والناقل، وكذلك كمية مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 المُضافين. س: هل هناك حدود لحجم المُدخلات التي يُمكن استنساخها؟ ج: يدعم NEB 10-beta استقرار البلازميدات الكبيرة، ويسمح الحجم الصغير لـ pMiniT باستنساخ المُدخلات الكبيرة. وقد تم استنساخ مُدخلات بحجم 4-5 كيلوبايت بسهولة. لاحظ أن المُدخلات الأكبر قد تتطلب نسبًا أقل بين المُدخل والناقل. س: هل خلايا E. coli المُؤهلة NEB 10-beta (كفاءة الاستنساخ) المُقدمة في المجموعة هي نفسها خلايا E. coli المُؤهلة NEB 10-beta (الكفاءة العالية)؟ ج: الخلايا هي نفسها، ولكنها تختلف بمقدار 10 أضعاف في كفاءة التحويل. تُشير اختباراتنا إلى أن مستوى كفاءة الاستنساخ المُقدم يدعم نتائج ممتازة لاستنساخ مُضخمات PCR. س: كيف يمكنني تحديد ما إذا كانت خلايا NEB 10-beta الخاصة بي مؤهلة؟ ج: يتم توفير الحمض النووي pUC19 كعنصر تحكم في المجموعة في حال رغب المستخدم في التأكد من كفاءة خلايا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المؤهلة المرفقة. على الرغم من أن هذا ليس مطلوبًا بشكل روتيني، إلا أنه يمكن التأكد من كفاءة التحويل بشكل مستقل عن طريق تحويل 100 بيكوغرام (2 ميكرولتر من المحلول المركز بتركيز 50 بيكوغرام/ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة واتباع بروتوكولات التحويل والزرع المعتادة. يجب أن تكون كفاءة التحويل الناتجة أكبر من 1 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة/ميكروغرام من الحمض النووي pUC19. س: هل يمكن خلط مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 معًا قبل إضافتهما إلى تفاعل الربط؟ ج: يمكن خلط مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 قبل بدء التفاعل. للتخزين طويل الأمد، يجب تخزين مزيج الاستنساخ 1 ومزيج الاستنساخ 2 في قوارير منفصلة. سيؤدي تخزين مزيج الاستنساخ 1 و2 معًا إلى انخفاض نشاط الإنزيم. س: أين تقع مواقع النسخ +1 لمُحفِّزات SP6 وT7 للنسخ والترجمة في المختبر؟ ج: يقع موقع +1 لمُحفِّز SP6 على بُعد 50 زوجًا قاعديًا قبل موقع الاستنساخ لنسخ الإدخالات المستنسخة باتجاه عقارب الساعة، بينما يقع موقع +1 لمُحفِّز T7 على بُعد 62 زوجًا قاعديًا بعد موقع الاستنساخ لنسخ الإدخالات المستنسخة عكس اتجاه عقارب الساعة. س: ما الفرق بين ناقل pMiniT الأصلي وناقل pMiniT 2.0 الخطي المُضمَّن حاليًا في المجموعة؟ ج: يتميز الإصدار 2.0 بثلاثة تحسينات: إضافة تسلسلات مُحفِّزات بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 وSP6 التي تُحيط بموقع الاستنساخ لنسخ الإدخالات المستنسخة في المختبر. إضافة سبعة مواقع تقييد جديدة، بما في ذلك أربعة مواقع إنزيمات تقييد للتعرف على ثمانية قواعد، تُحيط بموقع الاستنساخ، لتسهيل عملية التخطيط الخطي للجزء المُستنسخ في دراسات النسخ، ولزيادة خيارات استراتيجيات الاستنساخ الفرعي. إزالة موقع BsaI الموجود في جين ApR من خلال الطفرات الموجهة للموقع، لتسهيل استخدام الأجزاء/الوحدات المُستنسخة في تجميع Golden Gate. كلا نسختي العمود الفقري للناقل الخطي لهما نفس الوظيفة في مجموعة الاستنساخ. س: عند استنساخ قطعة PCR في ناقل pMiniT 2.0 المُرفق مع مجموعة استنساخ NEB PCR، أين يتم ربط الجزء المُستنسخ في موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) للناقل؟ ج: يتم ربط الجزء المُستنسخ بين النيوكليوتيدات 545 و546 من ناقل pMiniT 2.0. تقع نقطة الإدخال هذه بين مواقع التعرف على EcoRi وPacI في منطقة MCS للناقل.