مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E1555S، لونا سكريبت® متعددة الخطوات للتفاعل التسلسلي للبوليميراز العكسي (RT-PCR)

الفئات ذات الصلة: تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات : تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA). الأسئلة الشائعة حول تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA): س: هل يمكنني تحضير تفاعلات LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم. يحتوي مزيج إنزيمات LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR على إنزيم النسخ العكسي Luna WarmStart وإنزيم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 Hot Start. يتيح هذا التحكم المزدوج في درجة حرارة نشاط الإنزيم تحضير التفاعل ويضمن استقرار التفاعلات المُجهزة مسبقًا في درجة حرارة الغرفة. س: هل يمكنني إضافة بادئات سداسية عشوائية أو بادئات أوليجو (dT) إلى تفاعلات LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR؟ ج: لا يُنصح باستخدام بادئات سداسية عشوائية أو بادئات أوليجو (dT) مع تفاعلات LunaScript One-Step RT-PCR. قد يؤدي تضمين هذه البادئات إلى تقليل خصوصية تضخيم الهدف. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب الهيكسامرات العشوائية حضانة في درجة حرارة الغرفة لربط البادئات، لذا فهي غير متوافقة مع إنزيم النسخ العكسي Luna WarmStart، الذي يتطلب تنشيط WarmStart الكامل عند 50 درجة مئوية أو أعلى. بدلاً من ذلك، نوصي باستخدام بادئات خاصة بالجين. س: هل يمكنني تقليل حجم التفاعل في تفاعلات LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR؟ ج: نعم، بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن تقليل حجم التفاعل إلى النصف (من 25 ميكرولتر إلى 12.5 ميكرولتر) دون التأثير على ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ما عليك سوى تقليل حجم الكاشف مع استخدام نفس كمية الحمض النووي الريبي (RNA). قد يمثل تقليل الحجم أكثر من ذلك تحديًا للإعداد اليدوي نظرًا لصعوبة استخدام الماصة. س: كيف يمكنني تحديد درجة حرارة الربط لتفاعلات LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR؟ ج: يُنصح بشدة باستخدام حاسبة NEB Tm لتفاعلات LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR، حيث تميل درجات حرارة التلدين المثلى إلى أن تكون أعلى بالنسبة لإنزيم Q5 Hot Start DNA Polymerase. عند إجراء تفاعل RT-PCR متعدد الأهداف، استخدم درجة حرارة التلدين المحسوبة للمنتج المُضخّم ذي أدنى درجة حرارة تلدين. س: هل يُمكنني زيادة وقت النسخ العكسي لأكثر من 10 دقائق الموصى بها في بروتوكول LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR؟ ج: وقت النسخ العكسي الموصى به وهو 10 دقائق عند 55 درجة مئوية في بروتوكول LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR كافٍ لمعظم احتياجات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA). قد تؤدي زيادة وقت النسخ العكسي إلى 20 دقيقة إلى زيادة كمية المنتج عندما يكون التركيز النهائي لكل بادئ أقل من 0.1 ميكرومول. س: هل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُنتجة باستخدام مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR متوافقة مع نظام استنساخ TA؟ ج: تحتوي نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُنتجة بواسطة بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 Hot Start على نهايات DNA غير لاصقة، ويمكن استنساخها مباشرةً باستخدام مجموعة استنساخ NEB PCR (NEB #E1202). تتطلب أنظمة الاستنساخ القائمة على TA خطوة إضافة ذيل dA. س: ما هي أقل كمية مُدخلة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) موصى بها لمجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR؟ ج: يعتمد نجاح تضخيم الهدف على جودة عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) ووفرة التعبير الجيني للجين المستهدف. على سبيل المثال، تم الكشف عن مُضخّم GAPDH بطول 570 زوجًا قاعديًا من 0.01 بيكوغرام فقط من الحمض النووي الريبوزي البشري الكلي عالي الجودة. كما تم إنشاء مكتبات NGS ناجحة من 10 نسخ فقط من الحمض النووي الريبوزي الاصطناعي SARS-CoV-2 باستخدام بروتوكول ARTIC. س: ماذا أفعل إذا فشل مُضخّم مُعين في تفاعل مُتعدد باستخدام مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR؟ أ: أولًا، تأكد من أن طول القطعة المُضخَّمة يقع ضمن النطاق الموصى به من 100 إلى 1500 زوج قاعدي. إذا كان كذلك، ولكن لم يتم تضخيمها في تفاعل متعدد، فقم بإجراء تفاعل RT-PCR أحادي لتقييم أداء البادئات. أعد تصميم البادئات وفقًا للإرشادات الواردة في قسم النصائح والاعتبارات العامة من الدليل إذا لم يتم الحصول على تضخيم ناجح في تفاعل RT-PCR أحادي. إذا كانت مجموعة البادئات تعمل بشكل جيد في تفاعل RT-PCR أحادي، فقم بزيادة تركيزها في مجموعة البادئات (حيث يكون تركيز كل بادئ عادةً متساويًا) عن طريق المعايرة. من المرجح أن يُحسِّن هذا من تضخيمها في تفاعل RT-PCR متعدد. بالإضافة إلى إعادة توازن تركيز كل بادئ على حدة، مع ازدياد عدد الأهداف في تفاعل RT-PCR متعدد، قد ينخفض ​​تركيز كل بادئ على حدة، وبالتالي، قد يؤدي زيادة وقت التلدين أيضًا إلى تحسين أداء تفاعل RT-PCR بشكل عام. للحصول على أفضل النتائج، نوصي بتحديد وقت التلدين تجريبيًا بناءً على تركيز البادئات، بحيث يتراوح التركيز الكلي النهائي للبادئات بين 1 و4 ميكرومولار. س: هل يمكنني استخدام مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR لتضخيم قطع الحمض النووي الطويلة؟ ج: تم تحسين مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR لتفاعل RT-PCR المتعدد الذي يستهدف قطع الحمض النووي التي يتراوح طولها بين 100 و1500 زوج قاعدي، ويمكنها تضخيم قطع الحمض النووي التي يصل طولها إلى 3 كيلوبايت بشكل روتيني في تفاعلات أحادية. بالنسبة لقطع الحمض النووي الطويلة، يُرجى اختيار مجموعة OneTaq® One-Step RT-PCR (NEB #E5315) أو تفاعل RT-PCR ثنائي الخطوات. بالنسبة لتفاعل RT-PCR ثنائي الخطوات، استخدم مخطط اختيار تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) لتحديد إنزيم النسخ العكسي (RT) وإنزيم بوليميراز الحمض النووي (DNA) الأنسب لتطبيقك. س: هل يمكن استخدام مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR في سير عمل ARTIC لتسلسل جينوم فيروسات الحمض النووي الريبي؟ ج: نعم، يمكن استخدام هذه المجموعة لتضخيم جينومات فيروسات الحمض النووي الريبي باستخدام تقنية RT-PCR المتعددة المستخدمة في سير عمل ARTIC. قد يلزم إجراء المزيد من التحسينات لتحقيق توازن متساوٍ في عدد المُضخّمات وتغطية الجينوم. س: كيف أختار بين بروتوكولي RT-PCR أحادي الخطوة وثنائي الخطوة؟ ج: يوفر كلا البروتوكولين كشفًا قويًا لأهداف الحمض النووي الريبي. بناءً على تصميم تجربتك وأهدافك، قد تُفضّل أحد البروتوكولين على الآخر. يُرجى الرجوع إلى الجدول التالي: س: كيف أختار بين مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR ومجموعة OneTaq One-Step RT-PCR (NEB #E5315)؟ ج: تُمكّن كلتا المجموعتين من إجراء تفاعل RT-PCR أحادي الخطوة. يرجى الرجوع إلى الجدول أدناه كدليل للاختيار بين مجموعة LunaScript ومجموعة OneTaq One-Step RT-PCR (NEB #E5315).