نيو إنجلاند بيولابس، E1601L، مجموعة تجميع البوابة الذهبية NEBridge® (BsaI-HF® v2)

أكمل هذه المجموعة بمجموعة تجميع NEBridge Golden Gate (BsmBI-v2) ( الفئات ذات الصلة: مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات؛ التطبيقات: تجميع الحمض النووي والاستنساخ، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية، مواصفات مجموعة NEBridge® Golden Gate؛ المواد المطلوبة (غير المرفقة) : إدخالات محددة من قبل المستخدم، خلايا مؤهلة، مواد أخرى للتحويل، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500) ؛ الأسئلة الشائعة : س: لماذا يحتوي مزيج تجميع Golden Gate الآن على BsaI-HFv2؟ ج: أظهرت الأبحاث التي استخدمت أنظمة اختبار تجميع أكثر تحديًا مكونة من 12 و24 قطعة تفوقًا واضحًا لإنزيم BsaI-HFv2 المُعاد هندسته مؤخرًا على BsaI. ويتضح ذلك في كفاءة التجميع (عدد المتحولات)، ودقة التجميع (الدقة)، والزيادة المستمرة في تكوين التجميع عند أعداد دورات أعلى من المعتاد إذا لزم الأمر. المزيج مطابق للأصلي باستثناء استبدال إنزيم التقييد من النوع IIS. س: ما هي آلية تجميع Golden Gate؟ ج: تعتمد عملية التجميع على نشاطين إنزيميين متزامنين في تفاعل واحد، وهما هضم الحمض النووي باستخدام إنزيم القطع المحدد من النوع IIS وربط الحمض النووي باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase. مع مكونات المحلول المنظم المُحسَّنة ونسب الإنزيمات المُثلى، سيؤدي تفاعل واحد يحتوي على بلازميد الوجهة والقطع المُدرجة (مُضخَّمات PCR أو مُستنسخة مُسبقًا) إلى ربط القطع المُدرجة بالترتيب الصحيح وتراكم المنتج المُجمَّع بمرور الوقت. لا يحتوي التجميع النهائي على أي من مواقع التعرف المختارة من النوع IIS، مما يجعله غير قابل للهضم الإضافي. لمزيد من المعلومات، يُرجى الاطلاع على البرنامج التعليمي عبر الإنترنت على www.neb.com/goldengate. س: ما الذي يؤثر على كفاءة تجميع Golden Gate؟ ج: يُعد استنساخ القطعة المُدرجة الواحدة أكثر كفاءة بشكل ملحوظ من استنساخ القطع المُدرجة المتعددة. تنخفض كفاءة التجميع مع زيادة عدد القطع. كما أن وجود تسلسلات مُتكررة في القطعة المُدرجة سيُقلل من الكفاءة. بالنسبة للقطع المُدرجة التي يقل طولها عن 250 زوجًا قاعديًا أو يزيد عن 3 كيلوبايت، فإن الاستنساخ المُسبق سيزيد من الكفاءة. أخيرًا، تنطبق القيود العادية على الحجم الإجمالي للبلازميد، والتي تسمح بالحفاظ عليه بشكل مستقر في بكتيريا الإشريكية القولونية، على Golden Gate. تجميعات البوابة. تكون الكفاءة في أعلى مستوياتها مع تركيبات البلازميد المُجمَّعة بحجم 10-12 كيلوبايت تقريبًا. يمكن إنتاج تجميعات أكبر حجمًا، ولكن ذلك يتطلب فحص عدد أكبر من المستعمرات للتأكد من الحصول على المنتجات المُجمَّعة كاملة الطول الصحيحة. للاطلاع على أمثلة تجريبية توضح العلاقة بين التعقيد والكفاءة، يُرجى الرجوع إلى المذكرة الفنية لتجميع البوابة الذهبية. س: لماذا تستخدم العديد من المقالات المنشورة حول تجميع البوابة الذهبية مُدخلات مُستنسخة مسبقًا بدلًا من المُدخلات المُولَّدة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: تسمح المُدخلات المُستنسخة مسبقًا بتخزين المُدخلات بشكل مستقر، بينما يوفر استخدام مُدخلات الأمبليكون الوقت. يُعد التخزين المستقر لمُدخلات الأمبليكون أمرًا بالغ الأهمية، ويُفضل تخزينها في محلول مُنظَّم. يمكن استخدام مُدخلات أمبليكون غير مُنقَّاة في استنساخ/تجميع المُدخلات الفردية، ولكن ذلك سيؤدي إلى أداء أقل مقارنةً بالمُدخلات المُنقَّاة، بينما يجب تنقية مُدخلات الأمبليكون المُتعددة، على سبيل المثال، باستخدام بروتوكولات عمود الطرد المركزي. نوصي باستخدام مجموعة Monarch® PCR and DNA Cleanup Kit (NEB #T1030). للتخزين طويل الأمد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، يُخزَّن الحمض النووي في محلول 10 ملي مولار. يمكن استخدام محلول Tris (الأس الهيدروجيني 8.5) مع 1 ملي مولار من EDTA (TE)، أو التخزين قصير الأمد في محلول Tris (الأس الهيدروجيني 8.5) مع 10 ملي مولار من EDTA (TE معدل). لن يؤدي استخدام EDTA بهذه المستويات إلى خفض تركيز MgCl2 البالغ 10 ملي مولار الموجود في محلول T4 DNA Ligase Buffer المستخدم في تفاعلات التجميع بشكل ملحوظ. س: يبدو استخدام المضخمات النقية مباشرةً دون استنساخ مسبق أسهل بكثير، ولكن هل تنخفض كفاءة التجميع؟ ج: لا. على الرغم من أن الحمض النووي يكون أكثر استقرارًا بشكل عام في شكله الدائري مقارنةً بشكله الخطي نظرًا لعدم وجود نهايات حرة، إلا أن المضخمات تُعد طريقة فعالة وسهلة لبناء التجميعات طالما تم تنقيتها وتخزينها في المحلول المناسب (انظر الأسئلة الشائعة). النسبة المولية المقترحة 2:1 بين مُدخلات المضخمات وناقل الوجهة تجعل كفاءة التجميع مماثلة لكفاءة المُدخلات المستنسخة مسبقًا (باستخدام 75 نانوغرام من كل بلازميد) لمعظم التجميعات. س: هل يمكن استخدام مضخمات PCR مباشرةً في تفاعلات التجميع دون هل يتطلب الأمر تنقية؟ ج: نعم، طالما أن حجم الإدخال 1 ميكرولتر أو أقل، ويتم إجراء إدخال واحد (استنساخ). مع ذلك، ستنخفض الكفاءة. تُنتج معظم إنزيمات التقييد من النوع IIS المستخدمة في تجميع Golden Gate نهايات بارزة من 5' إلى أربعة قواعد، والتي يمكن أن يملأها بوليميراز الحمض النووي المتبقي المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عند استخدام نواتج تضخيم غير منقاة، مما ينتج عنه نهايات غير لاصقة. سيؤدي هذا إلى تجميع غير محدد. بالنسبة لاستنساخ/تجميع إدخال واحد، يتنافس الليغاز بنجاح مع بوليميراز الحمض النووي المتبقي، بحيث يمكن استخدام إدخالات نواتج تضخيم PCR غير المنقاة، ولكن سيؤدي ذلك إلى انخفاض أداء التجميع. بالنسبة لتجميعات Golden Gate متعددة الإدخالات، يجب تنقية نواتج التضخيم، وإذا كانت هناك منتجات غير محددة، فيجب تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التنقية باستخدام الهلام. س: لماذا يُستخدم Golden Gate أيضًا لاستنساخ إدخال واحد؟ ج: بينما يُستخدم Golden Gate عادةً لتجميعات إدخال من 5 إلى 10 أجزاء أو أكثر، فإنه يسمح أيضًا باستنساخ إدخالات مفردة بسهولة وكفاءة عالية باتباع التعليمات المُقدمة. التعليمات. يمكن أيضًا استخدام Golden Gate مع مجموعات متنوعة من الإدخالات الفردية لإعداد المكتبات والتطور الموجه الذي يتطلب طفرات متعددة المواقع. س: ماذا لو كانت هناك مواقع BsaI وBsmBI داخلية في تسلسلات الإدخال الخاصة بي؟ ج: إما استخدام الطفرات الموجهة للموقع لإزالة المواقع الداخلية مسبقًا، أو استخدام المواقع الداخلية كوصلات بين الأجزاء باستخدام البادئات لإدخال الطفرات الصامتة في التسلسل في وقت واحد أثناء توليد الجزء. أو فحص تسلسلاتك للتأكد من عدم وجود مواقع تقييد من النوع IIS أخرى يمكن أن تسمح باستخدام إنزيم تقييد بديل من النوع IIS مثل BbsI أو SapI/BspQI أو BtgZI (بناء تفاعلات التجميع الخاصة بك باستخدام مخزونات إنزيم التقييد الفردي وT4 DNA Ligase)، أو التفكير في نهج تجميع آخر مثل NEBuilder® HiFi DNA Assembly إذا كان التجميع سيشمل 5 إدخالات أو أقل. يرجى الرجوع إلى برنامج Golden Gate التعليمي للتدجين. س: لماذا تنتهي تفاعلات التجميع بخطوة حضانة لمدة 5 دقائق عند 60 درجة مئوية؟ ج: خطوة الحضانة النهائية عند تُفضّل درجة حرارة 60 درجة مئوية قطع إنزيم التقييد من النوع IIS، في حال عدم ربط الحمض النووي. ويؤدي هضم أي بلازميد وجهة غير مقطوع أو مقطوع/مُعاد ربطه لا يزال موجودًا في تفاعلات التجميع إلى تقليل التشويش. س: كيف يُمكنني تقليل الأخطاء الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في مُدخلات المُضخّم؟ ج: استخدم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة وتجنّب التضخيم المُفرط. نوصي باستخدام تركيبات بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® للحصول على أقصى دقة (NEB #M0491، #M0493)، وهو مُتوفر أيضًا بتنسيق Master Mix (NEB #M0492، #M0494). كذلك، استخدم الحد الأدنى من عدد الدورات اللازمة لتوليد كمية الحمض النووي المطلوبة للتجميع؛ وعادةً ما يكون هذا 20 دورة أو أقل. س: هل يُمكن تقليص حجم تفاعلات تجميع Golden Gate؟ ج: باستثناء تفاعلات التجميع المُعقدة جدًا ومتعددة المُدخلات، يُمكن تقليص حجم التفاعلات بمقدار 2-3 أضعاف إذا سمحت أحجام الإدخال بذلك. يُمكن القيام بذلك عن طريق تقليص حجم التفاعل و إما بنسب متناسبة للمكونات، أو بالحفاظ على حجم التفاعل 20 ميكرولتر مع استخدام كمية أقل بمقدار 2-3 أضعاف من كل مكون من مكونات الحمض النووي. في الحالة الأخيرة، قم بزراعة كمية أكبر من الخلايا النامية للتعويض. س: هل يمكنني استخدام سلالات أخرى من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤهلة غير سلالة NEB 10-beta؟ هل يمكنني استخدام خلايا ذات كفاءة عالية في الاستنساخ الفرعي؟ ج: نعم، يمكن استخدام سلالات خلوية أخرى، ولكن التجميعات الكبيرة تتطلب سلالات معروفة بقدرتها على الحفاظ على استقرار البلازميدات الكبيرة، مثل سلالة NEB 10-beta المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو سلالة NEB Stable المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة، NEB #C3040). كما يُوصى باستخدام سلالة NEB Stable المؤهلة من الإشريكية القولونية للإدخالات التي تحتوي على عناصر متكررة/غير مستقرة. بالنسبة للتجميعات الأصغر، يمكن استخدام سلالات أخرى مثل سلالة NEB 5-alpha المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة، NEB #C2987)، أو سلالة NEB Turbo المؤهلة من الإشريكية القولونية (عالية الكفاءة). يمكن أيضًا استخدام خلايا E. coli المؤهلة (NEB T7 Express Competent E. coli) ذات الكفاءة العالية (NEB #C2984) أو خلايا E. coli المؤهلة (NEB T7 Express Competent E. coli) ذات الكفاءة العالية (NEB #C2566). سيؤدي استنساخ الخلايا ذات الكفاءة العالية إلى انخفاض مستويات التحويل، ولا ينبغي استخدامها في عمليات التجميع متعددة المكونات. س: ما هو عنصر التحكم السلبي المناسب لتجميع Golden Gate؟ ج: لا تتطلب بروتوكولات تجميع Golden Gate عادةً عنصر تحكم سلبي. ومع ذلك، إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام تفاعل "بدون إضافة أي إدخالات". س: ما هو عدد الدورات الأمثل؟ ج: يسمح استقرار الإنزيم المحسن لدينا بعدد دورات أكبر من 30 دورة التقليدية إذا كان من المرغوب فيه الحصول على أعداد أكبر من المتحولات لعمليات التجميع المعقدة أو إنشاء مكتبة إدخال واحد. بالنسبة لكل من مجموعة التجميع الأصلية القائمة على BsaI-HFv2 ومجموعة التجميع القائمة على BsmBI-v2، تزداد الكفاءة بشكل كبير من 30 دورة إلى 60-65 دورة، دون أي فقدان في الدقة. س: أي مجموعة من NEB يجب أن أستخدمها لتجميع Golden Gate؟ هل أختار مجموعة BsmBI-v2 (NEB #E1602) أم مجموعة BsaI-HFv2 الأصلية (NEB #E1601)؟ ج: يعتمد ذلك على وجود مواقع داخلية لهذه الإنزيمات في تسلسلات الإدخال لديك. بما أن المواقع الداخلية يجب إزالتها عن طريق الطفرات الموجهة للموقع، فاختر المجموعة بناءً على إنزيم التقييد من النوع IIS الذي لا يحتوي على مواقع، أو يحتوي على أقل عدد ممكن من المواقع، في تسلسلات الإدخال لديك. إذا لم تحتوي تسلسلاتك على مواقع BsmBI أو BsaI، فإن مجموعة BsmBI-v2 (NEB #E1602) ستكون الخيار الأمثل لأنها تدعم أعلى أداء لتجميع المعقدات تم تطويره حتى الآن في NEB، سواء من حيث الكفاءة (عدد المتحولات) أو الدقة (نسبة التجميعات الصحيحة). مع ذلك، تدعم كلتا المجموعتين تجميعات معقدة مكونة من 24 قطعة. لديك أيضًا خيار استخدام NEBridge Ligase Master Mix (NEB #M1100) المصمم للاستخدام مع أي إنزيم تقييد من النوع IIS من NEB. س: كيف؟ هل يمكنني الوصول إلى pGGAselect كملف GenBank أو FASTA؟ ج: يرجى زيارة أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي للحصول على ملفات تسلسل pGGAselect بتنسيق FASTA أو GenBank، بالإضافة إلى خريطة البلازميد الخاصة به. س: هل يتداخل EDTA مع عملية التقييد والربط اللاحقة باستخدام BsaI؟ ج: لا. يحتوي محلول NEB Golden Gate Buffer بتركيز 1X على 10 ملي مولار من MgCl2. لن تؤثر إضافة القطع المُدخلة التي تحتوي على 0.1 ملي مولار من EDTA على مستوى MgCl2 المطلوب للإنزيمات. س: لماذا توجد خطوة تسخين عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في نهاية تفاعل التجميع؟ ج: تُفضل خطوة الحضانة النهائية عند 55 درجة مئوية عملية قطع BsaI، في حال عدم ربط الحمض النووي. يُقلل هضم أي بلازميد لا يزال موجودًا في تفاعلات التجميع من التشويش. يمكن لتجميع Golden Gate تحمل موقع BsaI داخلي واحد في قطعة واحدة؛ في هذه الحالة، احذف خطوة 55 درجة مئوية وافحص المزيد من المستعمرات لأن التشويش سيكون أعلى. س: كم عدد كم عدد أزواج القواعد التي يجب أن تحيط بموقع التقييد من النوع IIS في إدخالات الأمبليكون؟ ج: يجب أن تحتوي إدخالات الأمبليكون على قواعد محيطة من الطرف 5' ومواقع تقييد من النوع IIS عند طرفي الأمبليكون بالاتجاه الصحيح. نوصي بإضافة 6 قواعد محيطة عند الطرف 5' للبادئات لتحقيق أفضل ارتباط لإنزيم التقييد من النوع IIS، والقطع، وكفاءة تجميع Golden Gate بشكل عام. هذه التوصية المكونة من 6 أزواج من القواعد تتجاوز تفضيلات طول الطرف الأخرى المعروفة لإنزيمات التقييد من النوع IIS نظرًا لأن بروتوكولات تجميع Golden Gate تتطلب أقصى نشاط إنزيمي للتجميع الفعال.