نيو إنجلاند بيولابس، E1602L، مجموعة تجميع البوابة الذهبية NEBridge® (BsmBI-v2)

الفئات ذات الصلة: مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات. التطبيقات: تجميع الحمض النووي والاستنساخ، حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، مواصفات تجميع NEBridge® Golden Gate. المواد المطلوبة (غير المرفقة): قطع مُدخلة يحددها المستخدم، خلايا مؤهلة، مواد أخرى للتحويل. الأسئلة الشائعة : س: ما هي آلية تجميع Golden Gate؟ ج: يعتمد التجميع على نشاطين إنزيميين متزامنين في تفاعل واحد، وهما هضم الحمض النووي باستخدام إنزيم القطع الداخلي من النوع IIS، وربط الحمض النووي باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase. مع مكونات المحلول المنظم المُحسّنة ونسب الإنزيمات، سيؤدي تفاعل واحد يحتوي على بلازميد الوجهة وقطع مُدخلة (مُضخّمات PCR أو مُستنسخة مسبقًا) إلى ربط القطع المُدخلة بالترتيب الصحيح وتراكم المنتج المُجمّع بمرور الوقت. لا يحتوي التجميع النهائي على أي من مواقع التعرف المختارة من النوع IIS، مما يجعله غير قابل للهضم الإضافي. لمزيد من المعلومات، يُرجى الاطلاع على البرنامج التعليمي عبر الإنترنت على www.neb.com/goldengate. س: أي مجموعة من NEB يجب أن أستخدمها لتجميع Golden Gate - مجموعة BsmBI-v2 (NEB #E1602) أم مجموعة BsaI-HFv2 الأصلية (NEB #E1601)؟ ج: يعتمد ذلك على وجود مواقع داخلية لهذه الإنزيمات في تسلسلات الإدخال. بما أن المواقع الداخلية يجب إزالتها عن طريق الطفرات الموجهة للموقع، فاختر المجموعة بناءً على إنزيم التقييد من النوع IIS الذي لا يحتوي على مواقع، أو يحتوي على أقل عدد ممكن من المواقع، في تسلسلات الإدخال. إذا لم تحتوي تسلسلاتك على مواقع BsmBI أو BsaI، فإن مجموعة BsmBI-v2 (NEB #E1602) ستكون الخيار الأفضل لأنها تدعم أعلى أداء تجميع معقد تم تطويره حتى الآن في NEB من حيث الكفاءة (عدد المتحولات) والدقة (نسبة التجميعات الصحيحة). مع ذلك، تدعم كلتا المجموعتين تجميعات معقدة مكونة من 24 قطعة. لديك أيضًا خيار استخدام مزيج NEBridge Ligase Master Mix (NEB #M1100) المصمم للاستخدام مع أي إنزيم تقييد من النوع IIS من NEB. س: ماذا لو كانت هناك مواقع BsaI وBsmBI داخلية في تسلسلات الإدخال الخاصة بي؟ ج: إما أن تستخدم الطفرات الموجهة للموقع لإزالة المواقع الداخلية مسبقًا، أو تستخدم المواقع الداخلية كوصلات بين القطع باستخدام البادئات لإدخال الطفرات الصامتة في التسلسل في وقت واحد أثناء توليد الجزء. أو افحص تسلسلاتك للتأكد من عدم وجود مواقع تقييد أخرى من النوع IIS والتي يمكن أن تسمح باستخدام إنزيم تقييد بديل من النوع IIS مثل BbsI أو SapI/BspQI أو BtgZI (قم ببناء تفاعلات التجميع الخاصة بك باستخدام مخزونات إنزيم التقييد الفردي وT4 DNA Ligase)، أو فكر في نهج تجميع آخر مثل NEBuilder® HiFi DNA Assembly إذا كان التجميع سيتضمن 5 إدخالات أو أقل. يرجى الرجوع إلى برنامج Golden Gate Domestication Tutorial الخاص بنا. س: إنزيم القطع من النوع IIS المستخدم في هذه المجموعة هو BsmBI-v2. كيف يُقارن بالإنزيم الأصلي BsmBI أو Esp3I؟ ج: على الرغم من قدرة الإنزيمات الثلاثة على إجراء عمليات تجميع معقدة (24 قطعة)، إلا أن BsmBI-v2 يتميز بأعلى مستويات الكفاءة (عدد المتحولات) والدقة (نسبة التركيبات المُجمَّعة بشكل صحيح). استخدمت تجارب المقارنة هذه درجات الحرارة المُحسَّنة لكل إنزيم على حدة، وهي 42 درجة مئوية لـ BsmBI وBsmBI-v2، و37 درجة مئوية لـ Esp3I. س: كيف يُقارن أداء هذه المجموعة بالتركيبات المنزلية التي تُصنع باستخدام إنزيمات القطع من النوع IIS ومكونات T4 DNA Ligase بشكل منفصل؟ ج: إن بناء تفاعلات التجميع باستخدام مكونات إنزيمية منفصلة متوفرة بتراكيز مناسبة للهضم القياسي للحمض النووي محدود بسبب ضرورة الحفاظ على مستويات الجلسرين في التفاعلات عند 10% أو أقل. ستنجح هذه التجميعات "المُصنّعة منزليًا"، لكنها لن تُضاهي كفاءة ودقة هذه المجموعة التي تتميز بمستويات إنزيمية أعلى. س: ما الذي يؤثر على كفاءة تجميع Golden Gate؟ ج: يُعدّ استنساخ الإدخال الفردي أكثر كفاءةً بشكل ملحوظ من استنساخ الإدخالات المتعددة. تنخفض كفاءة التجميع مع ازدياد عدد القطع. كما أن وجود تسلسلات متكررة في الإدخال يُقلل من الكفاءة. بالنسبة للإدخالات التي يقل طولها عن 250 زوجًا قاعديًا أو يزيد عن 3 كيلوبايت، فإن الاستنساخ المسبق يزيد من الكفاءة. أخيرًا، تنطبق القيود المعتادة على الحجم الإجمالي للبلازميد، والتي تسمح بالحفاظ عليه بشكل مستقر في بكتيريا الإشريكية القولونية، على تجميعات Golden Gate. تكون الكفاءة في أعلى مستوياتها مع تركيبات البلازميد المُجمّعة التي يتراوح حجمها بين 10 و12 كيلوبايت. يُمكن صنع تجميعات مُكتملة أكبر حجمًا، لكن ذلك سيتطلب فحص عدد أكبر من المستعمرات للتأكد من الحصول على المنتجات المُجمّعة كاملة الطول. للاطلاع على أمثلة تجريبية تُبيّن العلاقة بين التعقيد والكفاءة، يُرجى الرجوع إلى المذكرة الفنية لتجميع Golden Gate. س: لماذا تستخدم العديد من المقالات المنشورة حول تجميع Golden Gate إدخالات مستنسخة مسبقًا بدلاً من الإدخالات المُولَّدة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: تسمح الإدخالات المستنسخة مسبقًا بتخزين الإدخالات بشكل مستقر، بينما يوفر استخدام إدخالات الأمبليكون الوقت. يُعد التخزين المستقر لإدخالات الأمبليكون أمرًا بالغ الأهمية، ويُفضل تخزينها في محلول منظم. يمكن استخدام أمبليكونات غير مُنقَّاة في عمليات الاستنساخ/التجميع لإدخال واحد، ولكن ذلك سيؤدي إلى أداء أقل مقارنةً بالاستنساخ/التجميع بعد التنقية، بينما يجب تنقية أمبليكونات الإدخالات المتعددة، على سبيل المثال، باستخدام بروتوكولات عمود الطرد المركزي. نوصي باستخدام مجموعة Monarch® PCR and DNA Cleanup Kit (NEB #T1030). للتخزين طويل الأمد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، يُخزن الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.5)، وEDTA بتركيز 1 ملي مولار (TE)، أو للتخزين قصير الأمد في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.5)، وEDTA بتركيز 0.1 ملي مولار (TE مُعدَّل). لن يؤدي استخدام EDTA بهذه المستويات إلى خفض تركيز MgCl2 البالغ 10 ملي مولار بشكل ملحوظ في محلول T4 DNA Ligase Buffer المستخدم في تفاعلات التجميع. س: يبدو استخدام المضخمات النقية مباشرةً دون استنساخ مسبق أسهل بكثير، ولكن هل تنخفض كفاءة التجميع؟ ج: لا. على الرغم من أن الحمض النووي يكون أكثر استقرارًا بشكل عام في شكله الدائري منه في شكله الخطي نظرًا لعدم وجود نهايات حرة، إلا أن المضخمات تُعد طريقة فعالة وسهلة لبناء التجميعات طالما تم تنقيتها وتخزينها في المحلول المناسب (انظر الأسئلة الشائعة). النسبة المولية المقترحة 2:1 بين مُدخلات المضخم وناقل الوجهة تجعل كفاءة التجميع مماثلة لكفاءة المُدخلات المستنسخة مسبقًا (باستخدام 75 نانوغرام من كل بلازميد) لمعظم التجميعات. س: هل يمكن استخدام مضخمات PCR مباشرةً في تفاعلات التجميع دون تنقية؟ ج: نعم، طالما أن حجم المُدخل 1 ميكرولتر أو أقل ويتم إجراء إدخال واحد (استنساخ). مع ذلك، ستنخفض الكفاءة. تُنتج معظم إنزيمات التقييد من النوع IIS المستخدمة في تجميع Golden Gate نهايات بارزة من 5' إلى أربعة قواعد، والتي يمكن أن يملأها بوليميراز الحمض النووي المتبقي المستخدم في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عند استخدام نواتج تضخيم غير مُنقّاة، مما يُنتج نهايات غير لاصقة. وهذا بدوره يؤدي إلى تجميع غير مُحدد. في حالة استنساخ/تجميع إدخال واحد، يتنافس الليغاز بنجاح مع بوليميراز الحمض النووي المتبقي، بحيث يمكن استخدام إدخالات نواتج تضخيم PCR غير المُنقّاة، ولكن ذلك سيؤدي إلى انخفاض كفاءة التجميع. بالنسبة لتجميعات Golden Gate متعددة الإدخالات، يجب تنقية نواتج التضخيم، وفي حال وجود منتجات غير مُحددة، يجب تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل أو التنقية باستخدام الهلام. س: لماذا يُستخدم Golden Gate أيضًا لاستنساخ إدخال واحد؟ ج: على الرغم من أن Golden Gate يُستخدم عادةً لتجميع إدخالات من 5 إلى 10 أجزاء أو أكثر، إلا أنه يسمح أيضًا باستنساخ إدخالات مفردة بسهولة وكفاءة عالية باتباع التعليمات المُقدمة. كما يُمكن استخدام Golden Gate مع مجموعات متنوعة من الإدخالات المفردة لإعداد المكتبات والتطور المُوجّه الذي يتطلب طفرات متعددة المواقع. س: لماذا تنتهي تفاعلات التجميع بخطوة حضانة لمدة 5 دقائق عند 60 درجة مئوية؟ ج: تُفضّل خطوة الحضانة النهائية عند 60 درجة مئوية قطع إنزيم التقييد من النوع IIS، في حال عدم ربط الحمض النووي. ويؤدي هضم أي بلازميد وجهة غير مقطوع أو مقطوع/مُعاد ربطه لا يزال موجودًا في تفاعلات التجميع إلى تقليل التشويش. س: كيف يُمكنني تقليل الأخطاء الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في مُدخلات المُضخّم؟ ج: استخدم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة وتجنّب التضخيم المُفرط. نوصي باستخدام تركيبات بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® للحصول على أقصى دقة (NEB #M0491، #M0493)، وهو مُتوفر أيضًا بتنسيق Master Mix (NEB #M0492، #M0494). كذلك، استخدم الحد الأدنى من الدورات اللازمة لتوليد كمية الحمض النووي المطلوبة للتجميع؛ وعادةً ما يكون هذا 20 دورة أو أقل. س: ما هو عنصر التحكم السلبي المُناسب لتجميع Golden Gate؟ ج: لا تتطلب بروتوكولات تجميع Golden Gate عادةً عنصر تحكم سلبي. مع ذلك، يمكن استخدام تفاعل "بدون إضافة أي إدخالات" إذا لزم الأمر. س: ما هو العدد الأمثل للدورات؟ ج: يسمح استقرار الإنزيم المُحسَّن لدينا بعدد دورات أكبر من الثلاثين دورة التقليدية، إذا لزم عدد أكبر من الخلايا المُحوَّلة للتجميعات المعقدة أو لإنشاء مكتبة إدخال واحد. بالنسبة لكلٍّ من مجموعة التجميع الأصلية القائمة على BsaI-HFv2 ومجموعة التجميع القائمة على BsmBI-v2، تزداد الكفاءة بشكل كبير من ثلاثين دورة إلى 60-65 دورة، دون أي فقدان في الدقة. س: هل يمكنني استخدام سلالات أخرى من الإشريكية القولونية ذات الكفاءة غير NEB 10-beta؟ هل يمكنني استخدام خلايا ذات كفاءة عالية في الاستنساخ الفرعي؟ ج: نعم، يمكن استخدام سلالات خلوية أخرى، ولكن التجميعات الكبيرة تتطلب سلالات معروفة بقدرتها على الحفاظ على استقرار البلازميدات الكبيرة، مثل بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C3040). كما يُوصى باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Stable المؤهلة للإدخالات التي تحتوي على عناصر متكررة/غير مستقرة. أما بالنسبة للتجميعات الأصغر، فيمكن استخدام سلالات أخرى مثل بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C2987)، أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Turbo المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C2984)، أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB T7 Express المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C2566). تؤدي خلايا كفاءة الاستنساخ الفرعي إلى مستويات تحويل أقل، لذا لا يُنصح باستخدامها في التجميعات متعددة المكونات. س: كيف يمكنني الوصول إلى pGGAselect كملف GenBank أو FASTA؟ ج: يرجى زيارة أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي للحصول على ملفات تسلسل pGGAselect بتنسيق FASTA أو GenBank، بالإضافة إلى خريطة البلازميد الخاصة به. س: كم عدد أزواج القواعد التي يجب أن تحيط بموقع التقييد من النوع IIS في إدخالات الأمبليكون؟ ج: يجب أن تحتوي إدخالات الأمبليكون على قواعد محيطة من الطرف 5' ومواقع تقييد من النوع IIS في كلا طرفي الأمبليكون بالاتجاه الصحيح. نوصي بإضافة 6 قواعد محيطة عند الطرف 5' للبادئات لتحقيق أفضل ارتباط لإنزيم التقييد من النوع IIS، والقطع، وكفاءة تجميع Golden Gate بشكل عام. تتجاوز هذه التوصية المكونة من 6 أزواج من القواعد تفضيلات طول النهاية الأخرى المعروفة لإنزيمات التقييد من النوع IIS نظرًا لأن بروتوكولات تجميع Golden Gate تتطلب أقصى نشاط إنزيمي للتجميع الفعال.