مجموعة نيو إنجلاند بيولابس، E1603S، phi29-XT RCA

الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، الأسئلة الشائعة حول التضخيم متساوي الحرارة: س: ما هي ميزة استخدام بوليميراز الحمض النووي phi29-XT بدلاً من النوع البري phi29؟ ج: بشكل عام، يُنتج بوليميراز الحمض النووي phi29-XT، في ظل الظروف المثلى، كمية أكبر من الناتج في وقت أقل من الإنزيم الأصلي. بالإضافة إلى ذلك، يتميز phi29-XT بحساسية أعلى من النوع البري phi29، مما يجعله مثاليًا عندما تكون كمية الحمض النووي المدخلة منخفضة للغاية (مثل فيمتوغرام من الحمض النووي الدائري). هذه الخصائص تجعل phi29-XT الخيار الأمثل لمعظم تطبيقات تضخيم الحمض النووي الدائري (RCA). النوع البري phi29 phi29-XT سريع (3-12 كيلوبايت/دقيقة) ✓ ✓ معالجة عالية ✓ ✓ دقة عالية ✓ ✓ إزاحة السلسلة ✓ ✓ درجة الحرارة المثلى 30 درجة مئوية - 42 درجة مئوية ✓ ✓✓ ✓ الحساسية ✓ ✓✓ س: كيف يمكنني زيادة إنتاجية RCA؟ ج: يمكن الحصول على إنتاجية أعلى لمنتج RCA عن طريق زيادة وقت الحضانة أو كمية الحمض النووي المدخل. يرجى ملاحظة أن زيادة وقت الحضانة قد تؤدي إلى تضخيم المزيد من المنتجات غير المحددة في حالة عدم وجود قالب. س: ما هو نطاق درجة الحرارة الذي يمكن استخدام مجموعة phi29-XT RCA فيه؟ ج: نطاق درجة حرارة التفاعل الأمثل هو من 40 إلى 42 درجة مئوية. لا يُنصح بالتضخيم باستخدام هذه المجموعة في درجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية. س: هل يمكن استخدام مجموعة phi29-XT RCA لإنتاج الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: نعم، يمكن إنتاج الحمض النووي أحادي السلسلة الطويل باستبدال البادئات العشوائية المقاومة للإكسونوكلياز ببادئ واحد أو أكثر أحادي الاتجاه (بتركيز نهائي يتراوح بين 0.2 و1 ميكرومتر). س: هل يمكن استخدام مجموعة phi29-XT RCA لتضخيم تراكيب الحمض النووي الدائرية الكبيرة مثل BACs وFosmids؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة phi29-XT RCA لتضخيم تراكيب الحمض النووي الدائرية الكبيرة. في حال استخدام حمض نووي BAC أو Fosmid نقي كمادة أولية، يُرجى اتباع البروتوكول المذكور في الدليل: phi29-XT RCA مع مدخلات الحمض النووي الدائري النقي. لتضخيم الحمض النووي البكتيري الاصطناعي (BAC) أو الفوسميد (Fosmid) مباشرةً من مستعمرة بكتيرية، يُرجى اتباع البروتوكول الوارد في القسم الثاني مع التعديلات التالية: فصل سلسلتي الحمض النووي: أعد تعليق مستعمرة واحدة في 5 ميكرولتر من محلول الفصل (60 ملي مولار KOH، 2 ملي مولار EDTA)، ثم قم بتحليل الخلايا/فصل سلسلتي الحمض النووي عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضعها فورًا على الثلج. عادل الحمض النووي المفصول باستخدام 5 ميكرولتر من محلول التعادل (75 ملي مولار Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني 7.0). لتحسين خصوصية تضخيم الحمض النووي البكتيري الاصطناعي/الفوسميد، يُوصى بشدة باستخدام أزواج بادئات محددة الموقع مقاومة للإكسونوكلياز (0.2-1 ميكرومولار) بدلاً من البادئات العشوائية. زد وقت تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA) إلى 4-8 ساعات. س: هل يجب أن يكون قالب الحمض النووي المدخل دائريًا؟ ج: يتطلب تضخيم الدائرة المتدحرجة قالب حمض نووي دائري. مع ذلك، يمكن للبادئات العشوائية المضمنة في هذه المجموعة أن ترتبط أيضًا بالحمض النووي الخطي، وسيقوم إنزيم phi29-XT بتضخيم الحمض النووي الخطي عبر آلية تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA). س: كيف يمكنني التحقق من نجاح التضخيم وخصوصية تفاعل RCA؟ ج: يمكن تقييم جودة وخصوصية منتج RCA عن طريق هضمه باستخدام إنزيم تقييد، ثم فصل نواتج الهضم على هلام أجاروز بجانب سلم الحمض النووي مثل Quick-Load® Purple 1 kb Plus DNA Ladder (NEB #N0550). يجب أن تُظهر نواتج RCA المهضومة نفس أحجام القطع المتوقعة لقالب الحمض النووي البلازميدي المهضوم. س: كيف يمكنني إزالة التفرعات من منتجات RCA؟ ج: يرجى الرجوع إلى الدليل للاطلاع على تعليمات إزالة التفرعات العامة. س: هل أحتاج إلى تنقية منتجات RCA قبل استخدامها في التطبيقات اللاحقة؟ ج: تتطلب العديد من التطبيقات اللاحقة تخفيف منتجات RCA فقط قبل الاستخدام. إذا لزم التنقية، يمكن تنقية منتجات RCA باستخدام خرز SPRI® بتركيز 0.6X، وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. س: كيف يمكنني تحديد كمية منتجات RCA؟ ج: يمكن تحديد كمية منتجات RCA مباشرةً باستخدام مجموعة Quant-iT® PicoGreen® dsDNA Assay Kit أو باستخدام مقياس التألق Qubit® بعد التخفيف إلى نطاق الكشف المناسب. بدلاً من ذلك، يمكن تحديد كمية منتجات RCA المنقاة عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر أو باستخدام جهاز NanoDrop®. س: هل يمكن تعطيل إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29-XT بالحرارة؟ ج: نعم، يمكن تعطيل إنزيم phi29-XT بالحرارة عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. س: هل يمكنني استخدام هذه المجموعة لإضافة 5-ميثيل-dCTP؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة phi29-XT RCA لإضافة 5-ميثيل-dCTP عن طريق استبدال ما يصل إلى 100% من dCTP بـ 5-ميثيل-dCTP (NEB #N0356). س: هل يعمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29-XT في محلول تفاعل إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29 من النوع البري؟ ج: نعم، يتضاعف إنزيم phi29-XT في محلول تفاعل إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29 من النوع البري بتركيز 1X (NEB #B0269). مع ذلك، يكون الناتج عادةً أقل مقارنةً بالتخليق في محلول تفاعل phi29-XT بتركيز 1X (NEB #B0572). س: هل يمكن استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29-XT في ظروف تفاعل RCA لإنزيم phi29 من النوع البري (محلول تفاعل إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29 بتركيز 1X عند 30 درجة مئوية)؟ ج: نعم، سيعمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29-XT في ظروف تفاعل إنزيم phi29 الطبيعي، وسيُنتج مردودًا مشابهًا للإنزيم الطبيعي في هذه الظروف. مع ذلك، يُتوقع الحصول على مردود أعلى لإنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29-XT عند إجراء التفاعل عند درجة حرارة 42 درجة مئوية. س: استخدام بادئات مُحددة لتفاعل تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA) مع phi29-XT. ج: بناءً على ملاحظات محدودة، تُعد البادئات التي يتراوح طولها بين 13 و16 قاعدة أكثر كفاءة من البادئات الأطول. كقاعدة عامة لتصميم البادئات (RCA، PCR، إلخ)، حاول تجنب وجود أكثر من 3 قواعد غوانين أو سيتوزين في القواعد الخمس الأخيرة لتجنب الارتباط الخاطئ. من الضروري حماية الطرف 3' من نشاط الإكسونوكلياز القوي لإنزيم phi29 عن طريق تضمين 2-3 روابط فوسفوروثيوات. س: ما الفرق بين مجموعة phi29-XT WGA (NEB #E1604) ومجموعة phi29-XT RCA (NEB #E1603)؟ ج: إن إنزيم بوليميراز الحمض النووي phi29-XT فعال في تضخيم الحمض النووي الدائري بتقنية التضخيم الدائري المتدحرج (RCA)، وكذلك الحمض النووي الجينومي بتقنية التضخيم متعدد الإزاحة (MDA). مع ذلك، صُمم إنزيم بوليميراز phi29-XT الموجود في مجموعة phi29-XT WGA (NEB #E1604) لتقليل التحيز في محتوى GC أثناء تضخيم الحمض النووي الجينومي البشري. أما بالنسبة لتقنية RCA، فننصح باستخدام مجموعة phi29-XT RCA (NEB #E1603).