مجموعة إثراء إيبي مارك® N6-ميثيل أدينوزين، من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E1610S

فئات Epimark ذات الصلة : الإثراء، تحليل الإبيترانسكريبتوم، تحليل الميثيلوم. المواد المطلوبة (غير المرفقة): محلول التفاعل (150 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5، 0.1% NP-40 في ماء خالٍ من النيوكلياز)، خرز مغناطيسي بروتين G (NEB #S1430)، رفوف مغناطيسية لفصل الخرز (NEB #S1506 أو #S1509)، مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch® (10 ميكروغرام) (NEB #T2030)، إيثانول 100%، إيثانول 70%، أنابيب طرد مركزي دقيقة Eppendorf® RNA/DNA LoBind (كتالوج Sigma #Z666548) أو ما يعادلها، رؤوس ماصة خالية من RNase، قفازات خالية من البودرة، ماء خالٍ من النيوكلياز. مواد اختيارية: بادئات لتضخيم الحمض النووي الريبوزي للتحكم: بادئ GLuc الأمامي. = 5´- CGACATTCCTGAGATTCCTGG - 3´ بادئ عكسي GLuc = 5´- TTGAGCAGGTCAGAACACTG - 3´ بادئ أمامي CLuc = 5´- GCTTCAACATCACCGTCATTG - 3´ بادئ عكسي CLuc = 5´- CACAGAGGCCAGAGATCATTC - 3´ مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560) مزيج Bio-Rad iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (رقم المنتج 172-5120) صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات 384 بئراً (Bio-Rad رقم المنتج HSP-3805) فيلم بصري (Bio-Rad رقم المنتج MSB-1001) الأسئلة الشائعة : س: ما مقدار الحمض النووي الريبوزي (RNA) الضابط الذي يجب استخدامه إذا أردت إضافته إلى عينتي؟ ج: إذا كنت تنوي إضافة جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) الضابطة إلى عينتك، فمن الضروري استخدام كمية أقل بكثير من تلك المستخدمة في إجراء ترسيب مناعي (IP) ضابط عليها وحدها. وذلك لأن جزيء الحمض النووي الريبوزي الضابط m6A مُعدّل بشكل كبير، وللأجسام المضادة ألفة عالية له. سيؤدي هذا إلى أن يصبح جزيء الحمض النووي الريبوزي الضابط m6A هو السائد في العينة بعد الترسيب المناعي. يُوصى باستخدام 1 ميكرولتر من تخفيف 1:1000 لكل جزيء حمض نووي ريبوزي ضابط (0.1 فيمتومول من كل جزيء). يمكن إضافة جزيئات الحمض النووي الريبوزي الضابطة قبل أو بعد تجزئة عينة الحمض النووي الريبوزي. في حال إضافتها بعد التجزئة، يجب تجزئة محلول مركز من جزيئات الحمض النووي الريبوزي الضابطة ثم تخفيفه قبل إضافته إلى العينة. س: هل سيرتبط الجسم المضاد بالحمض النووي DNA المحتوي على m6A؟ ج: لم يتم اختبار الجسم المضاد بشكل كافٍ على ركائز الحمض النووي DNA، ولكن من المرجح جدًا أن يعمل بشكل جيد على الحمض النووي DNA أحادي السلسلة الذي يحتوي على m6A. من المحتمل أن يرتبط هذا الجسم المضاد بالحمض النووي المزدوج الذي يحتوي على m6A أيضًا، ولكن قد تكون ألفته أقل بكثير من الركائز أحادية السلسلة. س: ما هو تركيز البروتين في الجسم المضاد N6-ميثيل أدينوزين؟ ج: يُصنع الجسم المضاد بناءً على نشاطه، ويمكن تعديل تركيزه بين الدفعات للحصول على أفضل النتائج. تحتوي المجموعة على 20 ميكرولتر من الجسم المضاد تكفي لـ 10 دورات من الترسيب المناعي (دورتان في كل دورة). س: لم أحصل على كمية كافية من الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتطبيقي اللاحق بعد دورتين من الترسيب المناعي. كيف يمكنني زيادة الكمية؟ ج: إحدى طرق زيادة استخلاص الحمض النووي الريبوزي هي إجراء دورة واحدة من الترسيب المناعي بدلًا من دورتين. عادةً ما تُنتج دورة واحدة كمية كافية من الحمض النووي الريبوزي المحتوي على m6A. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء الترسيب المناعي باستخدام 2 أو 3 أو 4 ميكرولتر من الجسم المضاد لكل دورة، لدورة واحدة أو دورتين. سيؤدي استخدام كمية إضافية من الجسم المضاد إلى استخلاص كمية أكبر من الحمض النووي الريبوزي، وستظل كمية الإثراء كبيرة. مع ذلك، قد يؤدي استخدام أكثر من 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى انخفاض نسبة التخصيب، نظرًا لاستخلاص كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي غير المعدل. س: ما هي الطريقة التي توصون بها لتجزئة الحمض النووي الريبي؟ ج: نوصي باستخدام وحدة تجزئة الحمض النووي الريبي بالمغنيسيوم NEBNext® (رقم المنتج في كتالوج NEB: E6150S) لهذا الغرض. مع ذلك، فإن أي بروتوكول معتمد لتجزئة الحمض النووي الريبي سيفي بالغرض شريطة أن ينتج عنه حمض نووي ريبي متوافق مع التطبيق اللاحق لعملية التخصيب. يُوصى بتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة الطرد المركزي أو استخلاص الفينول والكلوروفورم، ثم ترسيبه بالإيثانول بعد التجزئة.