نيو إنجلاند بيولابس، E1700S، مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA)

هل تحتاج إلى مساعدة في تصميم بادئات LAMP؟ استخدم الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، مواصفات التضخيم متساوي الحرارة. المواد المطلوبة (غير المرفقة ): بادئات LAMP (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، عينات الحمض النووي المستهدفة، ماء عالي النقاء (H2O) من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية، كتلة تسخين، حمام مائي، مقياس تعكر فوري أو جهاز تدوير حراري (مع قياس الفلورة الفوري إذا رغبت في ذلك)، وأوعية تفاعل مناسبة للجهاز. الأسئلة الشائعة : س: ما هي المكونات المضمنة في مجموعة WarmStart LAMP (DNA وRNA)؟ ج: تتضمن المجموعة مزيجًا رئيسيًا 2X يحتوي على محلول منظم للتفاعل مع جميع العوامل المساعدة اللازمة بتراكيز مُحسَّنة لتحليلات LAMP وRT-LAMP: dNTPs، MgSO4، بوليميراز Bst 2.0 WarmStart® DNA، وWarmStart RTx. تحتوي المجموعة أيضًا على أنبوب واحد من صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X، ترتبط بالحمض النووي المزدوج (dsDNA) للكشف الفوري عن تفاعل LAMP. لإجراء تفاعل LAMP، يضيف المستخدم البادئات، والحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA)، ويضبط تركيز المزيج الرئيسي إلى تركيز نهائي 1X. يمكن الاطلاع على التعليمات التفصيلية في دليل المجموعة. س: ما هي درجة الحرارة المثلى لتضخيم LAMP/RT-LAMP؟ ج: نوصي بـ 65 درجة مئوية كدرجة حرارة ابتدائية لتفاعل LAMP. مع ذلك، من الممكن إجراء تفاعلات LAMP وRT-LAMP عند درجات حرارة تتراوح بين 55 و70 درجة مئوية، وذلك حسب نوع مجموعة البادئات والأهداف. س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg++) في المزيج الرئيسي WarmStart LAMP/RT-LAMP؟ ج: يحتوي المزيج الرئيسي بتركيز 2X على 16 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، وبالتالي 8 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي بتركيز 1X. س: كيف أستخدم الصبغة الفلورية؟ ج: يمكن الكشف عن الصبغة الفلورية باستخدام قناة SYBR®/FAM في أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الشائعة. تُقدم الصبغة الفلورية المتداخلة بتركيز 50 ضعفًا، ونقترح استخدام 0.5 ميكرولتر من الصبغة لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP لمراقبة التضخيم على معظم أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري تخفيف الصبغة أكثر (إلى تركيز نهائي يتراوح بين 0.1 و0.5 ضعفًا). س: ما أنواع عينات/مواد الإدخال المتوافقة مع مخاليط LAMP/RT-LAMP؟ ج: تُعد تقنية LAMP عادةً تقنية قوية ومقاومة للمثبطات، ومزيج WarmStart® LAMP/RT-LAMP Master Mix قادر على التضخيم المباشر باستخدام أنواع مختلفة من العينات. للحصول على أعلى دقة وحساسية، نوصي باستخدام حمض نووي نقي كمدخل. معظم طرق تنقية القوالب الروتينية كافية، مثل مجموعات استخلاص الأحماض النووية Monarch®. نقترح استخدام 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص لتفاعل LAMP بحجم 25 ميكرولتر. يمكن استخدام أحجام عينات أكبر أو أصغر. يجب ألا يتجاوز حجم العينات في وسط النقل (VTM أو UTM) 2 ميكرولتر (8% حجم/حجم). س: ما هي سرعة ظهور النتيجة المتوقعة؟ ج: يختلف تضخيم الهدف تبعًا لعدة عوامل، منها تصميم البادئات (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، ونقاء القالب وكميته. نقترح البدء بفترة حضانة 30 دقيقة. يمكن تقصير هذه الفترة إلى 15-20 دقيقة مع المقايسات المُحسّنة أو الأهداف ذات النسخ العالية. بدلاً من ذلك، يمكن إطالتها إلى 60 دقيقة للعينات ذات المدخلات المنخفضة، أو العينات غير النقية، أو المقايسات الأبطأ. تجدر الإشارة إلى أنه عند إطالة وقت التفاعل، يجب مراقبة عينات التحكم السلبية (NTCs) للتأكد من عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة. س: كيف أتأكد من النتيجة الإيجابية؟ ج: تُنتج تفاعلات LAMP سلسلة من السلاسل المتكررة التي تحتوي على التسلسل المستهدف، وتختلف في حجمها. ولأن نواتج تضخيم LAMP تحتوي على تكرارات لنفس تسلسل الحمض النووي، فإنها عادةً ما تمتلك درجة انصهار فريدة تُؤكد تضخيم الهدف الصحيح. عند استخدام التألق في الوقت الحقيقي، يُمكن تضمين منحنى الانصهار أو التمسخ بعد حضانة LAMP. لمزيد من المعلومات، راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها في دليل مجموعة WarmStart LAMP. س: هل يُمكنني إعداد تفاعلات LAMP/RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم، إن إنزيمات بوليميراز الحمض النووي Bst وإنزيم النسخ العكسي المستخدمة في هذا المزيج الرئيسي هي تركيبات WarmStart®، لذا يتم تثبيطها بواسطة الأبتاميرات المُعدلة في درجة حرارة الغرفة. وبناءً على ذلك، يُمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة دون التأثير بشكل كبير على نشاط LAMP. لمزيد من المعلومات حول تعديل نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأبتاميرات، يُرجى الاطلاع على "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: Hot Start Taq وما بعده". س: هل يُمكنني استخدام dUTP وUDG لمنع التلوث المتبقي مع مزيج WarmStart LAMP الرئيسي؟ ج: نعم، مزيج WarmStart LAMP الرئيسي متوافق مع منع التلوث المتبقي باستخدام dUTP/UDG. لا يحتوي مزيج NEB #m1700 الرئيسي على dUTP، ولكن يُمكن إضافة 700 ميكرومول من dUTP (NEB #N0459) إلى المزيج دون تأثيرات ملحوظة على أداء تفاعل LAMP. تجدر الإشارة إلى أهمية استخدام UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي (NEB #M0372)، حيث أن درجة الحرارة الثابتة (65 درجة مئوية) لتفاعل LAMP غير كافية لتعطيل UDG الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية، وقد يؤدي استخدام شكل UDG الخاص بالإشريكية القولونية إلى تثبيط تفاعل LAMP. ببساطة، أضف 0.02 وحدة/ميكرولتر من UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي، وقم بإجراء التفاعلات في درجة حرارة الغرفة للتخلص من نواتج LAMP الملوثة. يتوفر حاليًا إصدار من مزيج LAMP الرئيسي المُصاغ باستخدام dUTP و Thermolabile UDG كمنتج مستقل (NEB #M1708) أو كمجموعة مع صبغة فلورية (NEB #E1708). س: يحتوي مزيج WarmStart LAMP الرئيسي على بعض الرواسب في الأنبوب بعد إذابته، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، يُعد ترسب مزيج LAMP الرئيسي بعد التجميد/الإذابة أمرًا طبيعيًا. من المهم إعادة تعليق المزيج عن طريق الخلط جيدًا أو استخدام جهاز الخلط الدوامي لإذابة جميع الرواسب، ولكن بعد التعليق، يمكن استخدام المزيج الرئيسي كالمعتاد. س: كيف أصمم بادئات LAMP؟ ج: قد يكون تصميم بادئات LAMP يدويًا أمرًا صعبًا، ونوصي بشدة باستخدام برامج متخصصة لسهولة التصميم وزيادة احتمالية نجاح التفاعل. نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB. نظرًا لاختلاف أداء ومستويات تضخيم الحمض النووي غير القالب حتى مع التصميم الحاسوبي، نوصي بتقييم 2-4 مجموعات كاملة من بادئات LAMP للحصول على أفضل حساسية ونوعية قبل اختيار المجموعة النهائية. للاطلاع على نظرة عامة حول كيفية تصميم بادئات LAMP واستخدامها، يُرجى مشاهدة البرنامج التعليمي لأداة تصميم بادئات LAMP، وقراءة هذه الملاحظة التطبيقية لمزيد من التفاصيل. س: ما الفرق بين مجموعة NEB #E1708: WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG) ومجموعة NEB #E1700: WarmStart LAMP (DNA وRNA)؟ ج: تحتوي كلتا مجموعتي LAMP على مزيج رئيسي 2X يحتوي على Bst 2.0 WarmStart® وWarmStart RTx لتضخيم أهداف RNA وDNA/cDNA، وصبغة فلورية LAMP 50X ترتبط بـ dsDNA للكشف في الوقت الحقيقي. تحتوي مجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG) على مزيج رئيسي مُصاغ باستخدام dUTP وUDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي (NEB #M0372)، مما يمنع تضخيم نواتج التفاعلات السابقة التي تحتوي على اليوراسيل. تقلل هذه الإضافات من احتمالية التلوث العابر (حيث يمكن لناتج تفاعل سابق أن يُستخدم بشكل غير متوقع كركيزة لتفاعل لاحق). س: حدث تضخيم في عينة (عينات) التحكم السلبية (NTC) بعد الحضانة متساوية الحرارة. ما السبب؟ ج: قد يشير التضخيم في عينة التحكم السلبية (بدون قالب) خلال 30 دقيقة إلى تلوث متبادل أثناء تحضير التفاعل أو إلى مشكلة عامة. بعض مجموعات البادئات أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي من غيرها. نوصي بتقييم مجموعتين على الأقل من بادئات LAMP لأي هدف محدد. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض صيغ التفاعل أو إجراءات العمل أكثر عرضةً للتضخيم غير النوعي مع مجموعات بادئات معينة، مثل: أحجام التفاعل الكبيرة في أوعية صغيرة (مثل 20 ميكرولتر في صفائح 384 بئرًا)، ودرجات حرارة التفاعل المنخفضة (مثل 60 درجة مئوية بدلًا من 65 درجة مئوية). عند استخدام جهاز التدوير الحراري في الوقت الحقيقي، يمكن تضمين منحنى الذوبان أو التمسخ بعد حضانة LAMP للتمييز بين التضخيم الزائف والتلوث المتبادل، حيث أن كل ناتج تضخيم LAMP سينتج عنه منحنى ذوبان فريد. إذا كانت نتيجة تفاعل NTC إيجابية عند إعادة الاختبار و/أو تغيير إجراءات العمل، فاستبدل جميع مخزونات الكواشف ونظف مساحة العمل بمطهر سطحي مناسب، مثل مبيض بنسبة 10% (تخفيف 1:10 من هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بتركيز 5.25-6.0%). س: ما هي طرق الكشف التي يمكن استخدامها لتجارب LAMP/RT-LAMP؟ ج: يتوافق مزيج LAMP الرئيسي مع مجموعة متنوعة من خيارات التصوير/الكشف، بما في ذلك قياس العكارة، والتألق، والقياس اللوني غير المعتمد على الرقم الهيدروجيني (مثل أزرق هيدروكسي نافثول)، والطرق القائمة على الهلام. تأتي مجموعات LAMP (NEB #E1700 وNEB #E1708) مع صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X ترتبط بالحمض النووي المزدوج (dsDNA) للكشف عن التألق في الوقت الحقيقي. س: هل هناك حاجة إلى خطوة حضانة منفصلة لتقنية RT-LAMP؟ ج: لا، ليست هناك حاجة إلى خطوة نسخ عكسي منفصلة لإجراء RT-LAMP، حيث أن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx سينتج الحمض النووي التكميلي (cDNA) أثناء الحضانة متساوية الحرارة عند 65 درجة مئوية. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نحن نقدم العديد من الخيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. أما مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA وRNA) (NEB #M1800) فيتضمن مؤشرًا لونيًا يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). وتتضمن الإصدارات المُحدثة من كلا المنتجين إنزيم UDG وdUTP غير المستقرين حراريًا لتقليل خطر التلوث العابر (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، يتوافق مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تتضمن جميع خلطات LAMP الرئيسية مزيجًا من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart لتضخيم سريع وفعال من كلٍ من الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا تتطلب كل خلطة سوى بادئات LAMP وعينات الحمض النووي DNA أو RNA المستهدفة، والتي يوفرها المستخدم. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ ج: التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه الطريقة إنزيم بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق مميزة من الحمض النووي DNA المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. يوفر LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: حيث يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام أجهزة قياس فورية وعالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) بإضافة بسيطة لإنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يُجرى تفاعل RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه للحمض النووي الريبوزي (RNA) مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، مما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتفاعل RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما نوع التنقية الموصى به لبادئات LAMP؟ ج: عند فحص مجموعات متعددة من بادئات LAMP لتحديد تلك ذات الأداء الأمثل لهدف معين، فإن إزالة الأملاح القياسية كافية بشكل عام. ومع ذلك، نوصي بتنقية بادئات FIP وBIP باستخدام PAGE أو HPLC كحد أدنى للفحص النهائي لضمان المتانة فيما يتعلق بوقت الكشف والحساسية.