نيو إنجلاند بيولابس، E1708L، مجموعة WarmStart® الفلورية بتقنية LAMP/RT-LAMP (مع UDG)

الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، مواصفات التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة ، المواد المطلوبة (غير المرفقة): بادئات LAMP (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، عينات الحمض النووي المستهدفة، ماء عالي النقاء (H₂O) من الدرجة المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية، كتلة تسخين، حمام مائي، مقياس تعكر فوري أو جهاز تدوير حراري (مع قياس الفلورة الفوري إذا رغبت في ذلك)، وأوعية تفاعل مناسبة للجهاز. الأسئلة الشائعة : س: ما هي درجة حرارة التضخيم المثلى لتقنية LAMP/RT-LAMP؟ ج: نوصي بـ 65 درجة مئوية كدرجة حرارة ابتدائية لتقنية LAMP. ومع ذلك، من الممكن إجراء تفاعلات LAMP وRT-LAMP عند درجات حرارة تتراوح بين 55 و70 درجة مئوية، اعتمادًا على طبيعة مجموعة البادئات والأهداف. س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg++) في مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP الرئيسي؟ ج: يحتوي المزيج الرئيسي بتركيز 2X على 16 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄)، وبالتالي 8 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي بتركيز 1X. س: كيف أستخدم الصبغة الفلورية؟ ج: يمكن الكشف عن الصبغة الفلورية باستخدام قناة SYBR®/FAM في أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الشائعة. تُقدم الصبغة الفلورية المتداخلة بتركيز 50 ضعفًا، ونقترح استخدام 0.5 ميكرولتر من الصبغة لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP لمراقبة التضخيم على معظم أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري تخفيف الصبغة أكثر (إلى تركيز نهائي يتراوح بين 0.1 و0.5 ضعف). س: ما أنواع عينات/مواد الإدخال المتوافقة مع مخاليط LAMP/RT-LAMP؟ ج: تُعد تقنية LAMP عادةً تقنية قوية ومقاومة للمثبطات، ومزيج WarmStart® LAMP/RT-LAMP Master Mix قادر على التضخيم المباشر باستخدام أنواع مختلفة من العينات. للحصول على أعلى دقة وحساسية، نوصي باستخدام حمض نووي نقي كمدخل. معظم طرق تنقية القوالب الروتينية كافية، مثل مجموعات استخلاص الأحماض النووية Monarch®. نقترح استخدام 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص لتفاعل LAMP بحجم 25 ميكرولتر. يمكن استخدام أحجام عينات أكبر أو أصغر. يجب ألا يتجاوز حجم العينات في وسط النقل (VTM أو UTM) 2 ميكرولتر (8% حجم/حجم). س: ما هي سرعة ظهور النتيجة المتوقعة؟ ج: يختلف تضخيم الهدف تبعًا لعدة عوامل، منها تصميم البادئات (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، ونقاء القالب وكميته. نقترح البدء بفترة حضانة 30 دقيقة. يمكن تقصير هذه الفترة إلى 15-20 دقيقة مع المقايسات المُحسّنة أو الأهداف ذات النسخ العالية. بدلاً من ذلك، يمكن إطالتها إلى 60 دقيقة للعينات ذات المدخلات المنخفضة، أو العينات غير النقية، أو المقايسات الأبطأ. تجدر الإشارة إلى أنه عند إطالة وقت التفاعل، يجب مراقبة عينات التحكم السلبية (NTCs) للتأكد من عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة. س: كيف أتأكد من النتيجة الإيجابية؟ ج: تُنتج تفاعلات LAMP سلسلة من السلاسل المتكررة التي تحتوي على التسلسل المستهدف، وتختلف في حجمها. ولأن نواتج تضخيم LAMP تحتوي على تكرارات لنفس تسلسل الحمض النووي، فإنها عادةً ما تمتلك درجة انصهار فريدة تُؤكد تضخيم الهدف الصحيح. عند استخدام التألق في الوقت الحقيقي، يُمكن تضمين منحنى الانصهار أو التمسخ بعد حضانة LAMP. لمزيد من المعلومات، راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها في دليل مجموعة WarmStart LAMP. س: هل يُمكنني إعداد تفاعلات LAMP/RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم، إن إنزيمات بوليميراز الحمض النووي Bst وإنزيم النسخ العكسي المستخدمة في هذا المزيج الرئيسي هي تركيبات WarmStart®، لذا يتم تثبيطها بواسطة الأبتاميرات المُعدلة في درجة حرارة الغرفة. وبناءً على ذلك، يُمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة دون التأثير بشكل كبير على نشاط LAMP. لمزيد من المعلومات حول تعديل نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأبتاميرات، يُرجى الاطلاع على "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: Hot Start Taq وما بعده". س: لاحظتُ وجود بعض الرواسب في أنبوب مزيج WarmStart LAMP Master Mix بعد إذابته، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، يُعدّ ترسب مزيج LAMP Master Mix بعد التجميد والإذابة أمرًا طبيعيًا. من المهم إعادة تعليق المزيج عن طريق الخلط الجيد أو استخدام جهاز الخلط الدوامي لإذابة جميع الرواسب، ولكن بعد التعليق، يمكن استخدام المزيج كالمعتاد. س: كيف أصمم بادئات LAMP؟ ج: قد يكون تصميم بادئات LAMP يدويًا أمرًا صعبًا، لذا يُنصح بشدة باستخدام برامج متخصصة لسهولة التصميم وزيادة احتمالية نجاح التفاعل. نوصي باستخدام أداة NEB LAMP Primer Design Tool. نظرًا لأن الأداء ومستويات التضخيم غير المعتمد على القالب قد تختلف حتى مع التصميم الحاسوبي، نوصي بتقييم 2-4 مجموعات كاملة من بادئات LAMP للحصول على أفضل حساسية ونوعية قبل اختيار المجموعة النهائية. للحصول على نظرة عامة حول كيفية تصميم بادئات LAMP واستخدامها، يُرجى مشاهدة البرنامج التعليمي لأداة LAMP Primer Design Tool، وقراءة هذه الملاحظة التطبيقية لمزيد من التفاصيل. س: ما الفرق بين مجموعة NEB #E1708: WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG) ومجموعة NEB #E1700: WarmStart LAMP (DNA وRNA)؟ ج: تحتوي كلتا مجموعتي LAMP على مزيج رئيسي بتركيز 2X يحتوي على Bst 2.0 WarmStart® وWarmStart RTx لتضخيم أهداف RNA وDNA/cDNA، وصبغة فلورية LAMP بتركيز 50X ترتبط بـ dsDNA للكشف الفوري. تحتوي مجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG) على مزيج رئيسي مُصاغ باستخدام dUTP وUDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي (NEB #M0372)، مما يمنع تضخيم نواتج التفاعلات السابقة التي تحتوي على اليوراسيل. تقلل هذه الإضافات من احتمالية التلوث المتبقي (حيث يمكن أن يعمل ناتج تفاعل سابق بشكل غير متوقع كركيزة لتفاعل لاحق). س: ما هي مكونات مجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG)؟ ج: تحتوي المجموعة على مزيج رئيسي بتركيز 2X، يتضمن محلول تفاعل مع جميع العوامل المساعدة اللازمة بتركيزات مُحسَّنة 2X لتحليلات LAMP: dNTPs، وMgSO4، وBst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase، وWarmStart RTx، وUntarctic Thermolabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)، وdTTP/dUTP. كما تحتوي المجموعة على صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X ترتبط بالحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) للكشف الفوري عن تفاعل LAMP. لإجراء تفاعل LAMP، يُضيف المستخدم البادئات، والحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA)، ويُعدِّل تركيز المزيج الرئيسي إلى تركيز نهائي 1X. يمكن الاطلاع على التعليمات التفصيلية في دليل المجموعة. س: هل يُتيح مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP الرئيسي بتركيز 2X (مع UDG) منع التلوث/تقليل التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) بمزيج من dTTP وdUTP. يضمن هذا المزيج تضخيمًا متساوي الحرارة فعالًا، بالإضافة إلى دمج dU في نواتج التفاعل. يحتوي المزيج أيضًا على UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي (NEB #M0372). تعمل نواتج LAMP التي تحتوي على dU كركيزة لإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز، مما يمنع التلوث الناتج عن انتقال الحمض النووي. يجب تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة (عادةً 22-25 درجة مئوية) قبل الحضانة متساوية الحرارة للسماح بتحلل نواتج التضخيم المحتوية على dU، أو، إذا رغبت، حضانة لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية قبل إضافة LAMP إلى سير العمل. نظرًا لأن LAMP يمكن أن ينتج كميات كبيرة من الحمض النووي في فترات زمنية قصيرة جدًا، فإن أفضل الممارسات لتقليل التلوث تتضمن عدم فتح تفاعلات LAMP بعد التضخيم. س: حدث تضخيم في عينة التحكم السلبية (NTC) بعد الحضانة متساوية الحرارة. ما السبب؟ ج: قد يشير التضخيم في عينة التحكم السلبية (بدون قالب) خلال 30 دقيقة إلى تلوث متبادل أثناء تحضير التفاعل أو إلى مشكلة عامة. بعض مجموعات البادئات أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي من غيرها. نوصي بتقييم مجموعتين على الأقل من بادئات LAMP لأي هدف محدد. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض صيغ التفاعل أو إجراءات العمل أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي مع مجموعات بادئات معينة، مثل: أحجام تفاعل كبيرة في أوعية صغيرة (مثل 20 ميكرولتر في صفائح 384 بئرًا)، ودرجات حرارة تفاعل منخفضة (مثل 60 درجة مئوية بدلًا من 65 درجة مئوية). في حال استخدام جهاز تدوير حراري فوري، يمكن تضمين منحنى الذوبان أو التمسخ بعد حضانة LAMP للتمييز بين التضخيم العشوائي والتلوث المتبادل، حيث أن كل ناتج تضخيم LAMP سينتج عنه منحنى ذوبان فريد. إذا كانت نتيجة تفاعل اختبار التحكم السلبي (NTC) إيجابية عند إعادة الاختبار أو عند تغيير إجراءات العمل، فاستبدل جميع مخزونات الكواشف ونظف مكان العمل بمطهر سطحي مناسب، مثل محلول مبيض بنسبة 10% (مخفف بنسبة 1:10 من محلول هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بتركيز 5.25-6.0%). س: ما هي مزايا استخدام اختبار التضخيم المتساوي الحراري القياسي (NEB #M1712، E1700، M1708، E1708) مقارنةً باختبار التضخيم المتساوي الحراري اللوني القائم على الرقم الهيدروجيني (NEB #M1800، M1804)؟ ج: تستخدم خلطاتنا الرئيسية لاختبار التضخيم المتساوي الحراري اللوني القائم على الرقم الهيدروجيني (NEB #M1800، NEB #M1804) محلولًا ضعيف التخزين المؤقت، مما يسمح بالكشف البصري باستخدام صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني. يمكن أن تكون هذه القراءة البصرية البسيطة مفيدة بشكل خاص للاختبارات عند الحاجة. مع ذلك، فإن سعة التخزين المؤقت المنخفضة المطلوبة لتحفيز تغير اللون من الوردي إلى الأصفر تحد من توافق العينات، حيث قد تؤثر مدخلات العينات عالية التخزين المؤقت أو العينات الحمضية على تغير اللون. تتميز الخلطات الرئيسية في منتجاتنا القياسية لتقنية LAMP (NEB #M1712، NEB #E1700، NEB #M1708) بقدرتها على تحمل أنواع مختلفة من مدخلات العينات بسهولة أكبر. كما تتوافق هذه المنتجات مع الكشف اللوني غير المعتمد على الرقم الهيدروجيني. تتيح الخلطات الرئيسية لتقنية LAMP/RT-LAMP من NEB خيارات متعددة فيما يتعلق بنوع العينة والتغير اللوني المرئي. أما الخلطات الرئيسية لتقنية LAMP اللونية المعتمدة على الرقم الهيدروجيني من NEB، سواءً مع إنزيم UDG (NEB #M1804) أو بدونه (NEB #M1800)، فهي ذات قدرة تخزين ضعيفة تسمح بالكشف المرئي عن التضخيم باستخدام صبغة الفينول الأحمر، وهي صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني. تسمح قدرة التخزين المنخفضة بانخفاض الرقم الهيدروجيني للتفاعل مع إنتاج البروتونات من تضخيم الحمض النووي المستهدف، مما يؤدي إلى تغير اللون من الوردي إلى الأصفر. يمكن أن تكون هذه القراءة المرئية البسيطة مفيدة بشكل خاص للاختبارات عند الحاجة. مع ذلك، فإنّ انخفاض سعة التخزين المؤقت المطلوبة للكشف القائم على الرقم الهيدروجيني يحدّ من توافق العينات مع مخاليط LAMP اللونية القائمة على الرقم الهيدروجيني. قد تُعيق مدخلات العينات ذات التخزين المؤقت العالي تغير اللون، بينما قد تُخفّض العينات الحمضية الرقم الهيدروجيني للتفاعل بدرجة كافية للتأثير على اللون الأولي. يتميز المزيج الرئيسي متعدد الأغراض LAMP/RT-LAMP 2X مع UDG (NEB #M1708، NEB #E1708) أو بدون UDG (NEB #E1700) بتخزين مؤقت كامل، ويمكنه تحمّل هذه الأنواع من مدخلات العينات بسهولة أكبر، مما يجعله متوافقًا مع الأصباغ اللونية الأخرى (مثل أزرق هيدروكسي نافثول، وهو مؤشر معدني). س: هل هناك حاجة إلى خطوة حضانة منفصلة لـ RT-LAMP؟ ج: لا حاجة إلى خطوة نسخ عكسي منفصلة لإجراء RT-LAMP، حيث سينتج إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx الحمض النووي التكميلي (cDNA) أثناء الحضانة متساوية الحرارة عند 65 درجة مئوية. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نوفر عدة خيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. أما مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA وRNA) (NEB #M1800) فتتضمن مؤشرًا لونيًا يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). تتضمن الإصدارات المحدثة من كلا المنتجين UDG وdUTP حساسين للحرارة لتقليل خطر التلوث المتبقي (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، فإن مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) متوافق مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تحتوي جميع مزيجات LAMP الرئيسية على مزيج من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase لتضخيم سريع وفعال من كل من أهداف الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. كل مزيج لا يتطلب سوى بادئات LAMP وعينات الحمض النووي DNA أو الحمض النووي الريبي RNA التي يوفرها المستخدم. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ ج: التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. يستخدم هذا الأسلوب إنزيم DNA بوليميراز مُزيح للسلسلة مثل إنزيم Bst DNA Polymerase و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق مميزة من الحمض النووي DNA المستهدف لتفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر تقنية LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: إذ يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام أجهزة قياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه بالحمض النووي الريبي (RNA) مقترن بأبتامر قابل للعكس يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، مما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا من تقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. سؤال: ما نوع التنقية الموصى به لبادئات LAMP؟ ج: عند فحص مجموعات متعددة من بادئات LAMP لتحديد تلك ذات الأداء الأمثل لهدف معين، يكون التخلص القياسي من الأملاح كافيًا بشكل عام. ومع ذلك، نوصي بتنقية بادئات FIP وBIP باستخدام PAGE أو HPLC كحد أدنى للاختبار النهائي لضمان دقة النتائج من حيث وقت الكشف والحساسية.