نيو إنجلاند بيولابس، E2060S، مجموعة HiScribe® T7 ARCA mRNA (مع إضافة ذيل)

يتضمن الآن أنبوبًا منفصلاً من DTT. الفئات ذات الصلة: تغطية الحمض النووي الريبوزي، وتخليق الحمض النووي الريبوزي، والنسخ في المختبر (IVT)، ومحاليل النيوكليوتيدات للحمض النووي الريبوزي. المواصفات : المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مجموعة HiScribe® T7 ARCA mRNA (مع إضافة ذيل) ومجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA (NEB #E2065) ومجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA (مع إضافة ذيل) (NEB #E2060)؟ ج: يمكن استخدام كلتا مجموعتي HiScribe T7 ARCA mRNA لتخليق الحمض النووي الريبوزي عن طريق التغطية المتزامنة مع النسخ باستخدام ARCA. توفر مجموعات HiScribe T7 ARCA mRNA حلاً سهلاً لإنتاج mRNAs المغطاة بـ ARCA. المجموعة E2065 مخصصة للقوالب التي تحتوي على ذيل Poly(A) مشفر. بالنسبة للقوالب التي لا تحتوي على ذيول بولي (أ) مشفرة، يحتوي المنتج #E2060 على بوليميراز بولي (أ) من الإشريكية القولونية لإضافة ذيول بولي (أ) بعد النسخ والتغطية. س: أستخدم حاليًا مجموعة mMessage mMachine® T7 Ultra Transcription Kit، ما هي مجموعة تصنيع mRNA من NEB التي يجب أن أستخدمها؟ ج: نوصي باستخدام مجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA (مع إضافة الذيل) (E2060) التي يمكن استخدامها للتغطية أثناء النسخ باستخدام ARCA، ثم إضافة ذيل بولي (أ) باستخدام بوليميراز بولي (أ) من الإشريكية القولونية. تحتوي مجموعة HiScribe على الكواشف والبروتوكولات اللازمة للتغطية الكاملة أثناء النسخ وإضافة الذيل باستخدام ARCA في تفاعلات التخليق. س: أستخدم حاليًا مجموعة MessageMAX™ T7 ARCA-capped Message Transcription Kit، ما هي مجموعة تصنيع mRNA من NEB التي يجب أن أستخدمها؟ ج: نوصي باستخدام مجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA (E2065) التي تقوم بتغطية طرف الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) أثناء عملية النسخ باستخدام إنزيم ARCA، ولكنها لا تحتوي على بوليميراز بولي (أ). تُستخدم هذه المجموعة عندما لا تكون هناك حاجة إلى إضافة ذيل بولي (أ) إنزيميًا، أو عندما يكون ذيل بولي (أ) مُشفّرًا في القالب. تحتوي مجموعة HiScribe على كواشف وبروتوكولات لتخليق ARCA أثناء عملية النسخ وتغطية طرف الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في 20 تفاعلًا. س: هل يمكن استخدام نيوكليوتيدات مُعدّلة مع مجموعات HiScribe T7 ARCA mRNA؟ ج: مجموعات HiScribe T7 ARCA mRNA قادرة على دمج 5mCTP وPseudo-UTP في الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA). يمكن إضافة ما يصل إلى 2.5 ملي مول من النيوكليوتيدات المُعدّلة إلى التفاعل دون التأثير بشكل كبير على كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA). يمكن استخدام أنواع أخرى من UTP وCTP المُعدّلة، ولكن ستختلف الكمية الناتجة اعتمادًا على خصائص النيوكليوتيدات. لا يُنصح باستخدام GTP وATP المُعدَّلين لأنهما يُؤثران سلبًا على كفاءة إضافة غطاء وذيل الحمض النووي الريبوزي الرسول (RNA). س: ما الفرق بين مجموعات HiScribe T7 ARCA mRNA ومجموعة HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (E2040) ومجموعة HiScribe T7 Quick RNA Synthesis Kit (E2050)؟ ج: يُرجى مراجعة جدول الاختيار لتحديد مجموعة HiScribe المناسبة لتطبيقك. س: هل يُمكنني استخدام مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kits لتنقية تفاعل النسخ المختبري (IVT)؟ ج: نعم، مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 ميكروغرام) (NEB #T2040) مُناسبة لتنقية تفاعلات النسخ المختبري التي لا يُتوقع أن يتجاوز ناتجها 50 ميكروغرام. إذا كان من المتوقع أن يتجاوز إنتاج الحمض النووي الريبوزي (RNA) من عملية النسخ المختبري 50 ميكروغرامًا، فنوصي بتقسيم التفاعل على عدة أعمدة تنقية الحمض النووي الريبوزي من نوع Monarch Spin (50 ميكروغرامًا) أو تنقيته باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي من نوع Monarch Spin (500 ميكروغرامًا) (NEB #T2050)، نظرًا لقدرتها الأكبر على الارتباط بالحمض النووي الريبوزي. س: كيف يمكنني تحسين إنتاج الحمض النووي الريبوزي المنخفض من تفاعل النسخ؟ ج: إذا أنتج تفاعل النسخ باستخدام القالب الخاص بك حمضًا نوويًا ريبوزيًا كامل الطول، ولكن كان الإنتاج أقل بكثير من المتوقع، فمن المحتمل أن تكون الملوثات الموجودة في قالب الحمض النووي (DNA) تثبط بوليميراز الحمض النووي الريبوزي، أو قد يكون تركيز الحمض النووي غير صحيح. بدلاً من ذلك، قد يلزم تنقية إضافية لقالب الحمض النووي. كما أن إضافة 5 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول (DTT) (التركيز النهائي) إلى تفاعل النسخ قد يساعد أيضًا في تحسين إنتاج الحمض النووي الريبوزي. س: هل النيوكليوتيدات المعدلة مضمنة في المجموعة؟ ج: النيوكليوتيدات المعدلة غير مضمنة في المجموعة، ولكن يمكن شراؤها بشكل منفصل. توفر شركة NEB النيوكليوتيدات المعدلة التالية: N1-ميثيل-سودويوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0431)، و5-ميثيل-سيتيدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0432)، وسودويوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0433)، و5-ميثوكسي-يوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0434). يتضمن دليل المجموعة بروتوكولًا مفصلًا لاستخدام النيوكليوتيدات المعدلة في تفاعل النسخ. س: هل أحتاج إلى إضافة DTT إلى التفاعل؟ ج: إضافة DTT (بتركيز نهائي 5 ملي مولار) إلى التفاعل اختيارية، ولكن يُنصح بها. إن بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) الموجود في المجموعة حساس للأكسدة، وقد يؤدي ذلك إلى انخفاض إنتاجية الحمض النووي الريبي بمرور الوقت نتيجةً للمعالجة المتكررة، وما إلى ذلك. قد تساعد إضافة DTT إلى التفاعل في استعادة أداء المجموعة في مثل هذه الحالات. لن تؤثر إضافة DTT على التفاعل في أي حال من الأحوال.