مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E2070S، مجموعة HiScribe® SP6 لتخليق الحمض النووي الريبوزي

الفئات ذات الصلة: تغطية الحمض النووي الريبوزي (RNA Capping)، تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA)، النسخ المختبري (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات لتحديد مواصفات الحمض النووي الريبوزي (RNA) . المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: ما هو تسلسل المحفز لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6؟ ج: تسلسل محفز SP6 هو 5' ATTTAGGTGACACTATAG 3'. يبدأ إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6 عملية النسخ عند النيوكليوتيد G المسطر في تسلسل المحفز ثنائي السلسلة. ثم يقوم الإنزيم بالنسخ باستخدام السلسلة المقابلة كقالب في الاتجاه من 5' إلى 3'. ستكون القاعدة الأولى في النسخة هي G. س: هل يتطلب النسخ باستخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6 بادئًا؟ ج: لا. على عكس بوليميرازات الحمض النووي (DNA)، لا حاجة إلى بوادئ لنشاط إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6. يجب أن تكون منطقة محفز SP6 مزدوجة السلسلة حتى يتمكن البوليميراز من التعرف على تسلسل المحفز، ويبدأ النسخ من آخر قاعدة غوانين (G). ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام السلسلة المقابلة كقالب من الطرف 5' إلى الطرف 3'. يمكن للبلازميدات الخطية، أو نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أو قليل النوكليوتيدات الاصطناعية المرتبطة بقليل نيوكليوتيد قصير يحتوي على محفز SP6، أن تعمل جميعها كقوالب للنسخ المختبري باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6. س: هل يترك بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 قاعدة إضافية في نهاية النسخة؟ ج: نعم، يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 أن يترك قاعدة واحدة أو بضع قواعد إضافية في الطرف 3' من النسخة، مما ينتج عنه مجموعة من النسخ ذات نهايات 3' غير متجانسة. س: هل يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6 عملية النسخ من قالب حمض نووي أحادي السلسلة؟ ج: لا. يجب أن تكون منطقة المحفز مزدوجة السلسلة حتى يتمكن البوليميراز من التعرف عليها وبدء عملية النسخ. يقوم البوليميراز بعد ذلك بنسخ الحمض النووي الريبوزي باستخدام الشريط المقابل كقالب في الاتجاه من 5' إلى 3'. س: هل يعمل بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6 على بلازميد غير مقطوع؟ ج: نعم، على الرغم من أن SP6 إنزيم شديد التكرار، وسيستمر في النسخ حول قالب دائري عدة مرات دون أن ينفصل. يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيمات تقييد تترك طرفًا غير لاصق أو نتوءًا في الطرف 5' أسفل الحمض النووي المستهدف، مما يؤدي إلى نسخ غير مكتمل. س: هل يمكن إنتاج حمض نووي ريبوزي شاذ باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي SP6؟ ج: نعم. وردت تقارير تفيد بإنتاج حمض نووي ريبوزي شاذ عند تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيمات تقييد تترك نتوءات في الطرف 3'. لتجنب ذلك، يجب تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيمات تقييد تترك طرفًا غير لاصق أو نتوءًا في الطرف 5' أسفل الحمض النووي المستهدف مباشرةً. س: هل يمكن استبدال مكونات مجموعة HiScribe SP6 RNA Synthesis Kit بإنزيم SP6 RNA Polymerase ومحلول التفاعل (NEB #M0207)؟ ج: لا. صُممت مكونات المجموعة خصيصًا، ويجب استخدامها وفقًا للبروتوكولات المرفقة للحصول على أفضل النتائج. تختلف تركيبات هذه المكونات عن الإنزيم والمحلول الموجودين في NEB #M0207، ولا يمكن استبدالها. س: ما هو تسلسل قالب التحكم SP6؟ ج: يمكن العثور على تسلسل قالب التحكم SP6 (pCLuc-SP6)، الذي يحتوي على جين لوسيفيراز Cypridina تحت سيطرة محفز SP6، في أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي على موقع neb.com. س: هل يمكنني استخدام مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kits لتنقية تفاعل النسخ المختبري (IVT)؟ ج: نعم، مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين (50 ميكروغرام) (NEB #T2040) مناسبة لتنظيف تفاعلات النسخ المختبري التي لا يُتوقع أن يتجاوز ناتجها 50 ميكروغرام. إذا كان من المتوقع أن يتجاوز ناتج الحمض النووي الريبوزي (RNA) في عملية النسخ المختبري 50 ميكروغرام، فنوصي بتقسيم التفاعل على عدة أعمدة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين (50 ميكروغرام) أو تنظيفه باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين (500 ميكروغرام) (NEB #T2050)، نظرًا لقدرتها الأكبر على الارتباط بالحمض النووي الريبوزي (RNA). س: هل تتضمن المجموعة نيوكليوتيدات معدلة؟ ج: لا تتضمن المجموعة نيوكليوتيدات معدلة، ولكن يمكن شراؤها بشكل منفصل. توفر شركة NEB النيوكليوتيدات المعدلة التالية: N1-ميثيل-سودويوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0431)، و5-ميثيل-سيتيدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0432)، وسودويوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0433)، و5-ميثوكسي-يوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0434). يتضمن دليل المجموعة بروتوكولًا مفصلًا لاستخدام النيوكليوتيدات المعدلة في تفاعل النسخ. س: هل أحتاج إلى إضافة DTT إلى التفاعل؟ ج: إضافة DTT (بتركيز نهائي 5 ملي مولار) إلى التفاعل اختيارية، ولكن يُنصح بها. إن بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) الموجود في المجموعة حساس للأكسدة، وقد يؤدي ذلك إلى انخفاض إنتاجية الحمض النووي الريبي بمرور الوقت نتيجةً للمعالجة المتكررة، وما إلى ذلك. قد تساعد إضافة DTT إلى التفاعل في استعادة أداء المجموعة في مثل هذه الحالات. لن تؤثر إضافة DTT على التفاعل في أي حال من الأحوال.