نيو إنجلاند بيولابس، E2080L، مجموعة HiScribe® T7 mRNA مع كاشف CleanCap® AG ...

يتضمن الآن أنبوبًا منفصلاً من DTT. الفئات ذات الصلة: تغطية الحمض النووي الريبي، وتخليق الحمض النووي الريبي، والنسخ في المختبر (IVT)، ومحاليل النيوكليوتيدات لتحديد مواصفات الحمض النووي الريبي. المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: هل أحتاج إلى تغيير تسلسل المحفز لاستخدام كاشف CleanCap® AG؟ ج: لا يلزم تغيير تسلسل محفز T7 RNA نفسه (5′ TAATACGACTCACTATA 3′) لأن المجموعة لا تزال تستخدم بوليميراز T7 RNA. ومع ذلك، يجب أن تكون القاعدتان البادئتان (+1 و+2) اللتان تقعان مباشرةً بعد محفز T7 هما "AG". (القاعدة +1 التي تلي محفز بوليميراز T7 RNA القياسي هي دائمًا "G". ومع ذلك، يمكن أن تكون القاعدة +2 أي قاعدة (N)). المحفز الأصلي مع القاعدة البادئة +1 (G) و+2 (N) 5′ TAATACGACTCACTATAGN 3′. التسلسل الجديد مطلوب للاستخدام مع كاشف CleanCap® AG (مع القواعد البادئة AG) 5′ TAATACGACTCACTATAAG 3′. س: كيف يمكنني تغيير التسلسل البادئ لقالب الحمض النووي المزدوج؟ ج: إذا كان التسلسل الذي ترغب في استخدامه مستنسخًا في بلازميد، فنوصي باستخدام مجموعة Q5® لتعديل المواقع الموجهة (NEB #E0554S) لتغيير القاعدتين البادئتين +1 و+2 إلى AG. قبل النسخ، يجب تحويل البلازميد إلى شكل خطي (باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو طرفًا بارزًا 5′) لإنشاء قالب نسخ مزدوج السلاسل في المختبر. راجع دليل المنتج لتحضير قالب الحمض النووي. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئ أمامي مصمم ليشمل محفز T7 (مع بضع قواعد في اتجاه 5′) وتغيير النيوكليوتيد G إلى A في النيوكليوتيد البادئ، بالإضافة إلى بعض التسلسلات اللاحقة. صمم البادئ العكسي ليرتبط بالمنطقة التي سينتهي عندها تسلسلك. س: هل ستكون القاعدة 5′ من الحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بي هي "A"؟ ج: نعم. ستكون قاعدة +1 A هي القاعدة الأولى المدمجة في الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنسوخ باستخدام مجموعة HiScribe® T7 mRNA مع كاشف CleanCap® AG. سيحتوي الحمض النووي الريبوزي (RNA) على بنية Cap1 طبيعية. س: هل يمكن استخدام بلازميد غير مقطوع كقالب لمجموعة HiScribe® T7 mRNA مع كاشف CleanCap® AG؟ ج: لا. إن بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 هو إنزيم شديد المعالجة، وسيستمر في النسخ حول قالب دائري عدة مرات دون أن ينفصل. يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيمات التقييد التي تترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5′ أسفل الحمض النووي المطلوب، مما يؤدي إلى نسخ متتابع. راجع دليل المنتج لمعرفة كيفية توليد قالب الحمض النووي. س: هل يمكن استخدام النيوكليوتيدات المعدلة مع مجموعة HiScribe® T7 mRNA مع كاشف CleanCap® AG؟ ج: نعم. للاستبدال الكامل، استبعد النيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات غير الموسوم المرفق مع المجموعة، وأضف نفس التركيز النهائي لنيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات معدل (CTP أو UTP) من اختيارك. يجب تجنب استخدام ATP المعدل لأنه سيتداخل مع دمج كاشف CleanCap® AG. تجدر الإشارة إلى أن بعض النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات المعدلة قد تؤثر على الناتج النهائي لتفاعل التخليق، وقد يلزم تحسين نسب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات المعدلة إلى غير المعدلة للاستبدالات الجزئية. يرجى الرجوع إلى البروتوكول في دليل المنتج لاستخدامه مع النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات المعدلة. س: كيف يمكنني تحسين ناتج الحمض النووي الريبوزي عند استخدام مجموعة HiScribe® T7 mRNA مع كاشف CleanCap® AG؟ أ: تأكد من إذابة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTPs) وكاشف CleanCap® AG ومحلول التخزين المؤقت 10X وقالب الحمض النووي المزدوج، وحفظها في درجة حرارة الغرفة أثناء تحضير التفاعل (احتفظ بمزيج بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على الثلج). تأكد من خلط هذه المكونات (النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات، وكاشف CleanCap® AG، ومحلول التخزين المؤقت 10X، وقالب الحمض النووي المزدوج) جيدًا قبل الاستخدام عن طريق الخلط اللطيف باستخدام جهاز الخلط الدوامي لمدة 2-3 ثوانٍ، ثم الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير لجمع السائل في قاع الأنبوب. حضّر التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب المذكور في الدليل. اخلط التفاعل بلطف عن طريق سحب المحلول ودفعه بالماصة، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير قبل نقل التفاعل إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من استخدام أنابيب وأطراف ترشيح خالية من إنزيم RNase، وارتداء القفازات دائمًا عند التعامل مع الكواشف والتفاعلات. تأكد من نظافة قالب الحمض النووي جيدًا، وتحقق من صحة التركيز. س: كيف يمكنني تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُصنّع باستخدام هذه المجموعة؟ ج: يمكن تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يزيد طوله عن 300 نيوكليوتيد باستخدام محلول كلوريد الليثيوم (LiCl) المُرفق مع المجموعة، وذلك باتباع التعليمات الواردة في دليل المستخدم. بدلاً من ذلك، نوصي باستخدام مجموعة Monarch® RNA Cleanup Kit، 500 ميكروغرام (NEB #T2050) لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA). يُتوقع أن يكون الناتج من تفاعل واحد للحمض النووي الريبوزي (RNA) غير المُعدّل باستخدام هذه المجموعة أكثر من 90 ميكروغرام. س: هل يمكن استبدال مكونات من مجموعات HiScribe® الأخرى، أو بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 (NEB #M0251)، أو محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNAPol Reaction Buffer) (NEB #B9012) في هذه المجموعة؟ ج: لا. تم تحسين تركيبة مكونات هذه المجموعة لعملية النسخ المختبري باستخدام 5 ملي مولار من CTP، و5 ملي مولار من GTP، و5 ملي مولار من UTP، و6 ملي مولار من ATP، و4 ملي مولار من كاشف CleanCap® AG في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر. س: هل تنصحون باستخدام قالب ترميز ذيل البولي (A) أم باستخدام بوليميراز البولي (A) من الإشريكية القولونية؟ ج: كلتا الطريقتين ستنتجان mRNA بذيل بولي (A). مع ذلك، فإن استخدام ذيل بولي (A) مُرمّز بالقالب سيقلل من وقت سير العمل الإجمالي ويؤدي إلى طول محدد لذيل البولي (A). في حال استخدام بوليميراز البولي (A) (NEB #M0276)، ننصح بتنقية تفاعل النسخ المختبري قبل إضافة ذيل البولي (A). استخدام بوليميراز البولي (A) سيؤدي إلى نطاق من أطوال الذيل وزيادة في وقت سير العمل. س: هل يمكنني استخدام نظير مختلف لكاشف CleanCap® مع هذه المجموعة؟ ج: نوصي باستخدام كاشف CleanCap® AG المرفق بهذه المجموعة، حيث تم تحسين تركيباته خصيصًا للاستخدام مع هذا النوع من نظائر غطاء ثلاثي النوكليوتيدات. لن يعمل كاشف CleanCap GG وكاشف CleanCap GG (3′ OMe) مع التركيبات ونسب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTPs) المتوفرة في هذه المجموعة. توفر شركة TriLink كاشف CleanCap AG (3′ OMe)، ولكنه لم يُختبر تحديدًا مع التركيبات المتوفرة في هذه المجموعة. س: هل تتضمن المجموعة نيوكليوتيدات معدلة؟ ج: لا تتضمن المجموعة نيوكليوتيدات معدلة، ولكن يمكن شراؤها بشكل منفصل. توفر شركة NEB النيوكليوتيدات المعدلة التالية: N1-ميثيل-سودويوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0431)، و5-ميثيل-سيتيدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0432)، وسودويوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0433)، و5-ميثوكسي-يوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات (NEB #N0434). يتضمن دليل المجموعة بروتوكولًا مفصلًا لاستخدام النيوكليوتيدات المعدلة في تفاعل النسخ. س: هل أحتاج إلى إضافة DTT إلى التفاعل؟ ج: إضافة DTT (بتركيز نهائي 5 ملي مولار) إلى التفاعل اختيارية، ولكن يُنصح بها. إن بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) الموجود في المجموعة حساس للأكسدة، وقد يؤدي ذلك إلى انخفاض إنتاجية الحمض النووي الريبي بمرور الوقت نتيجةً للمعالجة المتكررة، وما إلى ذلك. قد تساعد إضافة DTT إلى التفاعل في استعادة أداء المجموعة في مثل هذه الحالات. لن تؤثر إضافة DTT على التفاعل في أي حال من الأحوال.