مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E2610S، مجموعة أدينيل الحمض النووي 5'

الفئات ذات الصلة | ربط الحمض النووي الريبي | الأسئلة الشائعة | س: هل يمكن استخدام مجموعة أدينلة الحمض النووي 5' هذه لأدينلة قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة؟ ج: نعم، يمكن لهذه المجموعة أدينلة الطرف 5' من قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم Mth RNA Ligase؟ هل هو بروتين اندماجي؟ ج: إنزيم Mth RNA Ligase هو بروتين اندماجي His10 بوزن جزيئي 46 كيلو دالتون. س: ما هي نسبة الإنزيم إلى قليل النوكليوتيد التي توصون بها؟ ج: نوصي بنسبة مولية 1:1 من الإنزيم إلى قليل النوكليوتيد لأدينلة أصعب الركائز. بالنسبة لبعض قليل النوكليوتيدات، يكفي استخدام كمية أقل من الإنزيم بمقدار 2-4 أضعاف. س: هل يمكن استخدام إنزيم Mth RNA Ligase في محاليل NEBuffers أخرى؟ ج: لا. يتم تحقيق كفاءة الوسم المثلى لهذا الإنزيم فقط في محلول تفاعل أدينلة الحمض النووي 5' غير المعتمد على درجة الحرارة والمرفق مع المنتج. يُعدّ الرقم الهيدروجيني 6.0 بالغ الأهمية. س: هل يُمكن استخدام إنزيم Mth RNA Ligase للربط؟ ج: لا. ظروف التفاعل مُحسّنة لإضافة الأدينيل إلى الطرف 5' من الحمض النووي. س: هل يُحفّز البولي إيثيلين جلايكول (PEG) إضافة الأدينيل؟ ج: لا، لا يُحفّز البولي إيثيلين جلايكول (PEG) إضافة الأدينيل. س: ما تركيز الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الذي يجب استخدامه في تفاعل إضافة الأدينيل؟ ج: يُمكن استخدام تركيز يتراوح بين 0.05 و0.5 ملي مولار من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). يُعدّ تركيز 0.1 ملي مولار من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الأمثل لظروف التفاعل المُوصى بها. س: هل سيعمل الإنزيم في درجة حرارة منخفضة (مثل 37 درجة مئوية)؟ ج: يتطلب إنزيم Mth RNA ligase درجة حرارة مرتفعة للتنشيط، مع أعلى نشاط له عند 65 درجة مئوية. سيتطلب خفض درجة الحرارة إطالة وقت التفاعل، والذي يجب تحديده تجريبيًا. لتنقية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، تأكد من اتباع التوصيات المُفصّلة في السؤال رقم 8 من الأسئلة الشائعة T1030. س: كيف يُمكنني تحديد مدى إضافة الأدينيل؟ ج: يتحرك الأوليغونوكليوتيد المُؤَدْنَل أبطأ بمقدار قاعدة واحدة تقريبًا على هلام بولي أكريلاميد مُفَكِّك بنسبة 15 أو 20%. إذا تم وسم مجموعة الفوسفات 5'، فإنه يصبح مقاومًا للفوسفاتاز أيضًا. بالنسبة للأوليغونوكليوتيدات التي يزيد طولها عن 18 قاعدة، فإن مجموعة Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (T1030) هي المنتج الموصى به لتنقية الأوليغونوكليوتيدات المُؤَدْنَلة بعد التفاعل. يتوفر البروتوكول عبر الرابط التالي: Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 ميكروغرام). س: هل أحتاج إلى تنقية تفاعل الأدينلة قبل استخدام الأوليغونوكليوتيد في عملية الربط؟ ج: نوصي بالمعالجة الحرارية أو باستخدام بروتينيز K لتعطيل الإنزيم. يجب إزالة ATP الزائد من التفاعل، إما عن طريق الترسيب أو كروماتوغرافيا العمود، لمنع التداخل مع خطوة الربط اللاحقة. س: ما هو تركيب محلول تفاعل أدينلة الحمض النووي 5' بتركيز 1X؟ ج: محلول تفاعل أدينيل الحمض النووي 5' بتركيز 1X هو: 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 6.0 عند 25 درجة مئوية) 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم 5 ملي مولار ثنائي ثيوثريتول 0.1 ملي مولار إيديتات ثنائي الصوديوم س: ما مدى تحمل الملح لهذا الليغاز الحمض النووي الريبي؟ ج: NEB # RNA Ligase Salt Tolerance M0204 T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) ≤ 50 ملي مولار M0239 T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase) ≤ 50 ملي مولار M0242 T4 RNA Ligase 2, truncated ≤ 100 ملي مولار M0351 T4 RNA Ligase 2, trunc. K277Q ≤ 100 ملي مولار M0373 T4 RNA Ligase 2, trunc. KQ ≤ 100 ملي مولار، M0375 SplintR Ligase ≤ 50 ملي مولار، E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligase) ≤ 300 ملي مولار، M0319 Thermostable 5' App DNA/RNA Ligase ≤ 50 ملي مولار. س: كيف يمكنني زيادة حجم تفاعل الأدينلة؟ ج: للتطبيقات واسعة النطاق، يمكنك زيادة حجم التفاعل واستخدام Mth RNA Ligase عالي التركيز، المتوفر حصريًا من خلال قناة Custom Solutions. يتيح ذلك زيادة حجم تفاعل الأدينلة إلى 30 بيكومول من قليل النوكليوتيد و30 بيكومول من الإنزيم لكل ميكرولتر دون فقدان الكفاءة. بعد التفاعل، يمكن تنقية قليل النوكليوتيد عن طريق استخلاص الفينول والترسيب بالكحول أو كروماتوغرافيا العمود لإزالة البروتين وATP بشكل فعال.