مجموعة إثراء الحمض النووي للميكروبيوم من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E2612L، NEBNext®

الفئات ذات الصلة: إثراء الحمض النووي للميكروبيوم، مواصفات تحضير مكتبة تسلسل الجيل التالي . المواد المطلوبة (غير متوفرة): هضم الحمض النووي λ-HindIII (NEB #N3012)، حامل فصل مغناطيسي بستة أنابيب (NEB #S1506)، صبغة تحميل الجل الزرقاء (6X) (NEB #B7021)، ماء خالٍ من النيوكلياز، جل أجاروز 0.8%، محلول منظم TE 1X، درجة الحموضة 7.5، خرز Agencourt® AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) أو مجموعة كواشف Beckman SPRIselect (Beckman Coulter, Inc. #B23317)، إيثانول 100% للترسيب الكحولي، إيثانول 80% لـ AMPure XP أو SPRIselect DNA، أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الارتباط، خلاط دوار، جهاز تشغيل الجل، كتلة تسخين أو جهاز Thermomixer، جهاز طرد مركزي دقيق، بروتينيز K، جزيئي درجة بيولوجية (اختياري؛ مطلوب لاستخلاص الحمض النووي المضيف المُلتقط) (NEB #P8107) الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني حضانة عينة الحمض النووي المدخلة مع الخرز المرتبط بـ MBD2-Fc لفترة أطول؟ ج: نعم، لا بأس بفترات حضانة أطول، طالما أنها لا تتجاوز 4 ساعات. س: ما مدى أهمية نسبة خرز MBD2-Fc إلى الحمض النووي؟ ج: من الضروري أن تكون نسبة الخرز المرتبط بـ MBD2-Fc إلى الحمض النووي المدخل 1 ميكرولتر من الخرز المرتبط بـ MBD2-Fc لكل 6.25 نانوغرام من الحمض النووي (أو 160 ميكرولتر من الخرز المرتبط بـ MBD2-Fc لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخل). يُسمح بزيادة كمية الخرز بالنسبة إلى كمية الحمض النووي المدخل، على سبيل المثال 320 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المرتبط بـ MBD2-Fc لـ 2 ميكروغرام من الحمض النووي المدخل. س: ما هو الحد الأقصى لحجم الحمض النووي المدخل الذي يمكنني استخدامه لكل تفاعل؟ ج: نوصي باستخدام حجم عينة يصل إلى 200 ميكرولتر (1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخل) لـ 160 ميكرولتر من خرز بروتين A-MBD2Fc. يمكن استخدام أحجام عينة أكبر لـ 160 ميكرولتر من خرز بروتين A-MBD2Fc، لكننا لم نختبر كفاءة الإثراء لأحجام عينة أكبر من 200 ميكرولتر. س: هل تنجح هذه الطريقة مع الحمض النووي المتدهور؟ ج: لاحظنا أن حجم الحمض النووي وجودته يؤثران على فصل الحمض النووي للميكروبيوم، وكذلك الكمية الإجمالية لثنائيات النوكليوتيدات الميثيلية CpG. على سبيل المثال، يكون الحمض النووي لخلايا الأرومة الليفية البشرية الطبيعية (IMR-90) ميثيليًا بنسبة 4-5% من الجينوم، ويتم فصله بفعالية بهذه التقنية (يتم إزالة 90% من الحمض النووي البشري). أما الحمض النووي للسرطان (HeLa، Jurkat) فهو أقل ميثيليًا بنسبة 3%، وبالتالي تكون كفاءة الإثراء أقل. وبالمثل، إذا كان حجم قطعة الحمض النووي أقل من 15 كيلوبايت، فستكون كفاءة الإثراء أقل. كلما زاد حجم الحمض النووي المضيف وزادت مثيلته لمواقع CpG، كان الفصل أفضل. س: ما هي أفضل طريقة لتنقية الحمض النووي بعد التخصيب؟ ج: نوصي بتنقية الحمض النووي باستخدام خرز Ampure أو الترسيب بالإيثانول. س: إذا كان الحمض النووي لعينتي متدهورًا بشكل خاص، كما هو الحال مع عينات الميكروبيوم البرازي، فهل هناك أي تعديلات على البروتوكول من شأنها تحسين أداء مجموعة NEBNext لتخصيب الحمض النووي للميكروبيوم مع هذه العينات؟ ج: على الرغم من أن مجموعة NEBNext لتخصيب الحمض النووي للميكروبيوم مصممة للحمض النووي عالي الجودة والسليم، فقد أفاد المستخدمون بنجاحهم في تعديل البروتوكول لتحسين إصلاح عينات الحمض النووي منخفضة الجودة. يمكن الاطلاع على توصيات حول كيفية تعديل البروتوكول في Chiou و Bergey 2018، Scientific Reports (2018) 8:1975 DOI:10.1038/s41598-018-20427-9؛ وتشمل هذه التوصيات: عمليات غسل إضافية. يتم تعديل نسبة الخرز/الحمض النووي المضيف بناءً على نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). جولتان من الإثراء مفصولتان بإذابة باستخدام كلوريد الصوديوم. يُرجى الاطلاع أيضًا على البروتوكول هنا: https://www.protocols.io/view/microbiome-dna-enrichment-for-fecal-seq-using-the-kqdg3xn21g25/v1