نيو إنجلاند بيولابس، E2621X، مزيج التجميع الرئيسي للحمض النووي عالي الدقة NEBuilder®

تمت إعادة صياغة مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix بمكونات تحتوي على الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10238675. الفئات ذات الصلة: تركيب الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)، تجميع الحمض النووي، مجموعات الاستنساخ والطفرات. التطبيقات: NEBuilder® HiFi DNA Assembly، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية. المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: لست متأكدًا مما إذا كان عليّ اختيار NEBuilder HiFi DNA Assembly أو NEB Gibson Assembly؟ ما الفرق بين المنتجين؟ ج: يوفر NEBuilder HiFi DNA Assembly العديد من المزايا مقارنةً بـ NEB Gibson Assembly. يستخدم NEBuilder HiFi بوليميرازًا عالي الدقة خاصًا به، مما يؤدي إلى تقليل فحص/إعادة تسلسل التركيبات وتجميع عالي الدقة خالٍ من الأخطاء تقريبًا. تُمكّن هذه الميزة أيضًا من استخدام NEBuilder في تطبيقات مُحددة لا يُمكن استخدام NEB Gibson Assembly فيها: إذ يُزيل NEBuilder HiFi عدم تطابق النهايات 5' و3'، ويُمكن استخدامه في جولات تجميع مُتتالية. يُوفر هذا الوقت بتجنب خطوات تضخيم PCR المُستهلكة للوقت. يُمكن لـ NEBuilder HiFi ربط قطعتين من الحمض النووي المزدوج باستخدام قليل نيوكليوتيدات الحمض النووي أحادي السلسلة الاصطناعي لإنشاء بسيط وسريع (مثل إدخال رابط أو مكتبة gRNA). لمزيد من المعلومات والبيانات التفصيلية، يُرجى زيارة NEBuilderHifi.com. س: ما هي مزايا هذه الطريقة مُقارنةً بطرق الاستنساخ التقليدية؟ ج: يسمح تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi بإدخال قطعة واحدة أو أكثر من الحمض النووي في أي موضع تقريبًا من الناقل الخطي، ولا يعتمد على وجود مواقع تقييد ضمن تسلسل مُعين. لذلك، يتمتع المُستخدم بتحكم كامل في ما يتم تجميعه، ويُمكن تجنب إدخال تسلسل إضافي غير مرغوب فيه، والذي يُستخدم غالبًا لتسهيل مُعالجة تسلسلات الحمض النووي المُتعددة. علاوة على ذلك، تتميز طريقة تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi بالسرعة مقارنةً بالاستنساخ التقليدي القائم على إنزيمات التقييد. وأخيرًا، يمكن ربط عدد أكبر من شظايا الحمض النووي في تفاعل واحد بكفاءة أعلى من الطرق التقليدية. س: هل هناك أي اختلافات بين مزيج التجميع الرئيسي للحمض النووي NEBuilder HiFi ومجموعة استنساخ الحمض النووي NEBuilder HiFi؟ ج: مزيج التجميع الرئيسي للحمض النووي NEBuilder HiFi هو نفسه في كلا المنتجين. تحتوي مجموعة استنساخ الحمض النووي NEBuilder HiFi على بكتيريا E. coli إضافية من نوع NEB 5-alpha ذات الكفاءة الكيميائية. س: ما الفرق بين مزيج التجميع الرئيسي للحمض النووي NEBuilder HiFi/مجموعة استنساخ تجميع الحمض النووي/مجموعة الشظايا الكبيرة ومجموعة NEB Gibson Assembly Master Mix/Cloning Kit الحالية؟ ج: يستخدم مزيج التجميع الرئيسي للحمض النووي NEBuilder HiFi بوليميراز عالي الدقة. على الرغم من تشابه بروتوكولات هذه المجموعات، فإن المنتجات المُجمَّعة من مزيج التجميع الرئيسي NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ومجموعة الاستنساخ NEBuilder HiFi Cloning Kit تُنتج عادةً عددًا أكبر من المستعمرات. عند الحاجة إلى تجميع قطع DNA كبيرة (> 10 كيلوبايت) أو قطع متعددة (4+)، فإن زيادة منطقة التداخل إلى 30 زوجًا قاعديًا تُحسِّن كفاءة التجميع والتحويل. كما لا توجد رسوم ترخيص مطلوبة من شركة NEB لمنتجات NEBuilder. س: ما هي أكبر قطعة DNA مفردة تم تجميعها باستخدام مزيج التجميع الرئيسي NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تم استخدام مزيج التجميع الرئيسي NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لاستنساخ تركيب بطول 22.7 كيلوبايت. بالنسبة للمنتجات المُجمَّعة التي يزيد حجمها عن 15 كيلوبايت، توصي شركة NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهَّلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019)، والمُضمَّنة في حزمة تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi للقطع الكبيرة (NEB #E2623). كبديل، يُمكنك استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهَّلة كهربائيًا (NEB #C3020). س: كم عدد قطع الحمض النووي التي يُمكن تجميعها في تفاعل واحد؟ ج: يعتمد عدد قطع الحمض النووي التي يُمكن تجميعها في تفاعل واحد على طول القطع وتسلسلها. لقد استُخدم مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتجميع ما يصل إلى أحد عشر قطعة مُدرجة بحجم 0.4 كيلوبايت بكفاءة في ناقل واحد في المرة الواحدة. مع ذلك، نوصي بتجميع خمس قطع مُدرجة أو أقل في ناقل واحد في تفاعل واحد، وذلك لإنتاج نسخة مُستنسخة تحتوي على القطعة المُدرجة الصحيحة. يمكن استخدام استراتيجية التجميع المتسلسل إذا تعذر تجميع جميع القطع في تفاعل واحد. بدلاً من ذلك، يُنصح باستخدام تجميع البوابة الذهبية لتجميع أكثر من 6 قطع. س: هل هذه الطريقة قابلة للتطبيق على تجميع التسلسلات المتكررة؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب التأكد من أن كل قطعة من الحمض النووي تتضمن تداخلًا فريدًا حتى تتمكن التسلسلات من الالتحام والترتيب بشكل صحيح. يمكن أيضًا دمج التسلسل المتكرر في المرحلة الأولى من استراتيجية التجميع ثنائية المراحل. إذا كان وجود تسلسلات متكررة في نهايات كل قطعة أمرًا لا مفر منه، فقد يتم إنتاج تجميع الحمض النووي الصحيح، وإن كان بكفاءة أقل من التجميعات الأخرى غير المقصودة. بدلاً من ذلك، يُنصح باستخدام تجميع البوابة الذهبية للتجميعات التي تحتوي على تسلسلات متكررة. س: ما هي أقصر التداخلات التي يمكن استخدامها مع طريقة التجميع هذه؟ ج: تم تحقيق تجميع فعال لقطع الحمض النووي بتداخل لا يقل عن 12 زوجًا قاعديًا، ولكن ذلك يعتمد على محتوى GC للتداخل. نوصي باستخدام تداخلات لا تقل عن 15 زوجًا قاعديًا، أو أكثر، لتجميع الحمض النووي المزدوج (dsDNA) عند درجة انصهار (Tm) ≥ 48 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجات مئوية). كما أن زيادة طول التداخل بين القطع يقلل من كمية الحمض النووي اللازمة للتجميع. س: ما هي أطول التداخلات التي يمكن استخدامها مع هذه الطريقة؟ ج: تم تحسين كل من كمية الإكسونوكلياز 5' في مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ووقت تفاعل التجميع البالغ 15 دقيقة لتجميع جزيئات الحمض النووي ذات تداخلات ≤ 20 زوجًا قاعديًا. في حال زيادة وقت تفاعل التجميع إلى 60 دقيقة، يمكن استخدام تداخلات تصل إلى 30 زوجًا قاعديًا مع مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix. س: هل يمكن تجميع قطع الحمض النووي المزدوج (dsDNA) التي يبلغ طولها ≤ 200 زوجًا قاعديًا بهذه الطريقة؟ ج: نعم. للحصول على أفضل النتائج، استخدم هذه القطع بزيادة ≥ 5 أضعاف. س: هل يمكن تجميع عدة جزيئات أوليغونوكليوتيدات من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) مع أجزاء من الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA)؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب تحديد التركيز الأمثل لكل أوليغونوكليوتيد. كنقطة بداية، نوصي باستخدام 45 نانومول من كل أوليغونوكليوتيد، بحيث يكون تركيزه أقل من أو يساوي 12 أوليغونوكليوتيدًا مكونًا من 60 قاعدة، مع تداخل 30 قاعدة. لمزيد من المعلومات، يُرجى تنزيل مذكرة التطبيق بعنوان: "بناء ناقل تعبير sgRNA-Cas9 عبر ربط جزيئات أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي أحادي السلسلة بأجزاء من الحمض النووي ثنائي السلسلة". س: هل يمكن استخدام فترات حضانة أطول أو أقصر؟ ج: نعم. لتجميع 2-3 أجزاء، تكفي فترة حضانة 15 دقيقة. لتجميع 4-6 أجزاء، يُوصى بفترة حضانة 60 دقيقة. لا يُنصح عمومًا بفترات تفاعل أقل من 15 دقيقة. وقد ثبت أن فترات الحضانة الممتدة (حتى 4 ساعات) تُحسّن كفاءة التجميع في بعض الحالات. لا تترك التفاعل يحضن طوال الليل. س: هل سينجح التفاعل عند درجات حرارة أخرى؟ ج: تم تحسين التفاعل عند 50 درجة مئوية، ولكن ثبتت فعاليته بين 40 و50 درجة مئوية. س: هل من الضروري تنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عند تجميع الحمض النووي باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix أو مزيج Gibson Assembly Master Mix؟ ج: تنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) غير ضرورية عمومًا. يمكنك استخدام نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) غير المنقاة مباشرةً، طالما أن الحجم الإجمالي لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) غير المنقاة في تفاعل التجميع لا يتجاوز 20%. في حال استخدام كميات أكبر من نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، نوصي باستخدام مجموعة تنقية تعتمد على الأعمدة (Monarch PCR & DNA Cleanup Kit، NEB #T1030). في حال تضخيم أجزاء متعددة أو ملاحظة وجود ثنائيات البادئات، نوصي بتحسين خطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للحصول على أفضل النتائج. س: هل من الضروري تعطيل إنزيمات التقييد بعد هضم الناقل؟ ج: تعطيل إنزيمات القطع المحددة ليس ضروريًا بشكل عام، ولكنه قد يزيد من كفاءة التحويل في بعض الحالات. إذا كان كل من الجزء المُدخل والمنتج النهائي المُجمَّع يحملان موقع القطع المستخدم في تحويل الناقل إلى شكل خطي، فمن الضروري تعطيل إنزيم القطع بالحرارة أو تنقية الناقل المقطوع إذا لم يكن التعطيل بالحرارة ممكنًا. س: أرغب في إنتاج شظايا متداخلة من الحمض النووي المزدوج (dsDNA) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هل أحتاج إلى استخدام بادئات PCR مُنقَّاة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية المُزالة الأملاح. س: أرغب في تجميع قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) في شظايا من الحمض النووي المزدوج (dsDNA). هل أحتاج إلى استخدام قليل النوكليوتيدات مُنقَّاة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية المُزالة الأملاح. للحصول على مزيد من المعلومات، يُرجى تنزيل مذكرة التطبيق بعنوان "بناء ناقل تعبير sgRNA-Cas9 عبر ربط قطع DNA مزدوجة السلسلة بجزيئات قليلة النوكليوتيدات من الحمض النووي أحادي السلسلة". س: هل يُمكنني استخدام تداخل بطول 15 نيوكليوتيدًا مُكوّنًا بالكامل من تكرارات علامة الهيستيدين (مثل CACCACCACCACCAC)؟ ج: لا، يجب عليك إحاطة تسلسل علامة الهيستيدين من كلا الجانبين بنيوكليوتيدين على الأقل لا يُشكلان جزءًا من تسلسل تكرار علامة الهيستيدين. بدلاً من ذلك، يُمكنك إدخال كودونات الهيستيدين CAC وCAT لقطع هذا التسلسل المُتكرر. يجب عليك تجنب التسلسلات المُتكررة في نهاية التداخل. س: هل يُمكنني تضخيم المنتج المُجمّع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: نعم. جزيء DNA المُجمّع مُرتبط تساهميًا، ويُمكن تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المنتج النهائي جزيء DNA دائريًا مُغلقًا، فيُمكن استخدامه كقالب في تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). س: لا ينتج عن تفاعل التحكم الإيجابي NEBuilder أي مستعمرات. لماذا؟ ج: تشير اختباراتنا إلى أن اختيار الخلايا المؤهلة أمر بالغ الأهمية. نوصي باستخدام خلايا مؤهلة كيميائيًا عالية الكفاءة، مثل خلايا NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة) (NEB #C2987). قم بتحويل الخلايا المؤهلة باستخدام عنصر التحكم pUC19 DNA للتأكد من أن الخلايا قابلة للحياة. س: ماذا أفعل إذا لم ينتج عن تفاعل التجميع أي مستعمرات، أو عدد قليل من المستعمرات، أو مستنسخات ذات حجم إدخال غير صحيح بعد التحويل إلى E. coli؟ ج: قم بتجميع وتحويل عنصر التحكم الإيجابي المرفق مع مجموعة NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/Cloning Kit. سيُظهر التجميع الناجح لعنصر التحكم الإيجابي أن خليط التجميع فعال وأن ظروف التحويل مناسبة. حلل التفاعل على هلام الأغاروز. سيُظهر تفاعل التجميع الفعال منتجات مُجمَّعة بالحجم الصحيح واختفاء الشظايا. تحقق من تصميم البادئات لقطع الحمض النووي المتداخلة للتأكد من وجود تداخل كافٍ لتسهيل التجميع. ضع في اعتبارك ما إذا كان الجزء المُستنسخ سامًا لبكتيريا الإشريكية القولونية، وفي هذه الحالة، يُنصح باستخدام ناقل منخفض النسخ، مثل ناقل BAC. س: كيف يُمكنني تقليل عدد مستعمرات الخلفية الناتجة عن الناقل فقط؟ ج: لتقليل مستعمرات الخلفية غير المرغوب فيها الناتجة عن الناقل فقط بشكل ملحوظ، يجب أن يكون الناقل ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وليس قطعة تقييد. إذا استمرت مشكلة الخلفية، يُمكن معالجة الناقل المُضخّم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام إنزيم DpnI لإزالة بقايا القالب، إن وُجدت، والمستخرجة من هلام الأغاروز بعد الفصل الكهربائي. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تركيبات الحمض النووي الناتجة متوافقة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي شركة NEB باستخدام خلايا NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كان حجم المنتجات المُجمّعة أكبر من 15 كيلوبايت، توصي شركة NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهلة للتحويل الكهربائي (NEB #C3020). أما إذا احتوت الجينات المُجمّعة على تسلسلات متكررة، فيُنصح باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB المُؤهلة والمستقرة (NEB #C3040). هل أنت مُتردد في اختيار سلالة الاستنساخ المُناسبة؟ يُتيح لك جهاز أخذ عينات بكتيريا الإشريكية القولونية NEB Cloning Competent E.coli Sampler (NEB #C1010) أخذ عينات من 4 سلالات شائعة لدينا من السلالات المُؤهلة كيميائيًا. سؤال: هل يُمكنني استخدام التحويل الكهربائي بدلًا من التحويل الكيميائي؟ جواب: نعم، ولكن من الضروري تخفيف ناتج تفاعل تجميع جيبسون بمقدار 3 أضعاف، واستخدام 1 ميكرولتر فقط للتحويل الكهربائي. ملاحظة: الخلايا المُرفقة مع هذه المجموعة مُؤهلة كيميائيًا. س: هل توجد أي اختلافات بين متطلبات تجميع 2-3 قطع مقابل 4 قطع أو أكثر؟ ج: الاختلافات الرئيسية بينهما هي طول التسلسلات المتداخلة بين القطع المتجاورة ووقت حضانة تفاعل التجميع. يُوصى ببروتوكول تفاعل التجميع لمدة 15 دقيقة لتجميع 2-3 قطع محاطة بتداخلات من 15-20 نيوكليوتيد. يُوصى ببروتوكول التجميع لمدة ساعة واحدة لتجميع 4 قطع أو أكثر، محاطة بتداخلات من 20-30 نيوكليوتيد. س: هل يمكنني استخدام ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُضخّم بواسطة بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: نعم. ستتم إزالة قاعدة الأدينين الإضافية في الطرف 3' لناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء تجميع الحمض النووي إذا أصبحت بقايا غير متطابقة بمجرد ارتباط القطع. س: هل يمكنني استخدام أدوات تصميم البادئات الأخرى مثل SnapGene لتجميع Gibson، لتصميم البادئات لتجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi؟ ج: قواعد تصميم البادئات متشابهة لكل من تقنية جيبسون لتجميع الحمض النووي وتقنية NEBuilder HiFi لتجميع الحمض النووي. أي بادئ مصمم لتقنية جيبسون سيعمل مع NEBuilder HiFi. مع ذلك، قد لا تعمل بعض البادئات المتوافقة مع NEBuilder HiFi مع تقنية جيبسون، لأن NEBuilder HiFi، على عكس مزيج جيبسون الرئيسي، قادر على إزالة عدم تطابق النهاية 3'. قد لا تسمح الأدوات المصممة لبادئات "جيبسون" بتصميم بادئات تستفيد من هذه الميزة في NEBuilder HiFi. على الرغم من إمكانية استخدام أدوات أخرى، توصي NEB باستخدام أداتنا المجانية، NEBuilder Assembly Tool، لأنها قادرة على تصميم بادئات تأخذ في الاعتبار نهايات المتجه الناتجة عن هضم إنزيم التقييد. س: هل لديكم أي اقتراحات لتحسين تجميع الحمض النووي عند استخدام الحمض النووي المصنّع (مثل gBlocks) ومزيج NEBuilder HiFi الرئيسي لتجميع الحمض النووي (E2621/E5520/E2623)؟ ج: يمكن أن يؤدي إدخال خطوة تضخيم في سير العمل إلى نتائج أفضل. تضخيم وحدات gBlocks باستخدام بوليميراز عالي الدقة مثل Q5 (M0491S) كخطوة أولى في سير عمل التجميع يمكن أن يزيد من كمية الحمض النووي المتاحة للتجميع، وبالتالي عدد البلازميدات المُجمَّعة بشكل صحيح. س: أريد ربط قطعتين، لكن تسلسل التداخل يبعد 500 زوج قاعدي عن نهاية الناقل. هل يمكن لمزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix تحقيق ذلك؟ ج: يمكن استخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لربط قطعة من الحمض النووي تبعد 20 زوجًا قاعديًا عن نهاية الناقل. لربط قطعة على مسافة أكبر من النهاية، أضف إلى المزيج الرئيسي 0.1-0.3 وحدة من إنزيم T5 Exonuclease. خفف إنزيم T5 Exonuclease (M0663، 10 وحدات/ميكرولتر) في محلول rCutSmart Buffer بتركيز 1X. بعد ذلك، أضف الإنزيم المخفف إلى تفاعل التجميع مع مزيج DNA الرئيسي بتركيز 2X. حضّن المزيج عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم انقله إلى خلايا مؤهلة عالية الكفاءة مثل NEB 5-alpha أو NEB 10-beta. يجب تخفيف إنزيم T5 Exonuclease مباشرةً قبل الاستخدام، ولا يمكن تخزينه في محلول rCutSmart Buffer بتركيز 1X. س: كيف يمكنني تحسين كفاءة تفاعلات التجميع المعقدة جدًا عند استخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: قد يحتوي تفاعل التجميع المعقد جدًا على 6 قطع DNA أو أكثر، بما في ذلك نواتج هضم إنزيمات التقييد غير المنقاة. على سبيل المثال، قد تستخدم قطعة DNA مُدرجة تم استخلاصها من بلازميد ولكن لم يتم تنقيتها، بحيث يكون هناك قطعتان من DNA: القطعة المُدرجة والناقل الأصلي. ستتجمع القطعة المُدرجة فقط مع القطع الأخرى. يمكن زيادة كفاءة تفاعلات التجميع المعقدة هذه عن طريق حضانة التفاعلات عند 45 درجة مئوية بدلًا من 50 درجة مئوية. نوصي باستخدام 0.05 بيكومول من كل بلازميد مهضوم، بحد أقصى 0.5 بيكومول من الحمض النووي في التفاعل. س: هل يمكن لمزيج NEBuilder® HiFi DNA Assembly الرئيسي إزالة عدم تطابق النهايتين 3′ و5′؟ ج: نعم، يمكن لـ NEBuilder HiFi إزالة عدم التطابق هذه حتى 10 أزواج قاعدية من النهاية، مما يسمح لنهايات الحمض النووي بالالتحام دون بروز. س: كيف يتم تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنظيف القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخَّم أكبر من 95%. إذا تم استخدام الحمض النووي للبلازميد كقالب أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، فيمكن إزالته بمعالجة DpnI إذا لزم الأمر. في حالة ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا لم يكن ذلك ممكنًا، يُوصى بالتنقية باستخدام الجل. قد يؤدي استخلاص الجل إلى إدخال غوانيدين ثيوسيانات (من محلول الإذابة) مما قد يقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الجل بحيث يمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام عمود الفصل. يمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع. س: أرغب في تصغير عملية تجميع الحمض النووي باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix وجهاز Labcyte Echo Liquid Handler. هل لديكم أي معلومات يمكنني الرجوع إليها لمساعدتي في أتمتة عملية تجميع الحمض النووي؟ ج: تتوفر المراجع التالية من شركة Labcyte: مذكرة تطبيقية: تجميع الحمض النووي متعدد القطع المصغر، مذكرة فنية: تجميع الحمض النووي المعياري لـ PIK3CA باستخدام النقل الصوتي السائل في أحجام نانولتر، مذكرة فنية: تجميع الحمض النووي على نطاق نانولتر باستخدام مجموعة استنساخ NEBuilder HiFi. س: كيف يؤثر طول التداخل على كفاءة تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi؟ ج: يزيد التداخل الأطول (20-30 زوجًا قاعديًا) من كفاءة التجميع. تم تجميع أربعة أجزاء (~20 فمول) بتداخل 15 أو 20 زوجًا قاعديًا باستخدام مزيج التجميع الرئيسي NEBuilder HiFi DNA (NEB #E2621) عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لإنشاء ناقل pUC19. تم تحويل 2 ميكرولتر من المزيج المُجمَّع إلى بكتيريا E. coli المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) ونُشرت على طبق LB/Amp يحتوي على IPTG وX-gal. تم عد المستعمرات الزرقاء التي تشير إلى التجميع الصحيح. يُعدّ مزيج تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi أكثر كفاءةً عند استخدام تداخل 20 زوجًا قاعديًا مقارنةً بتداخل 15 زوجًا قاعديًا. س: ما هي مقاومة المضادات الحيوية المُشفّرة في عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder (عنصر التحكم في التجميع)؟ ج: عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder عبارة عن إدخال واحد في بلازميد pUC19 مقاوم للأمبيسيلين. إذا كان مزيج التجميع يعمل بشكل صحيح، فستحصل على مستعمرات على طبق أمبيسيلين باستخدام عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder. س: أستخدم مجموعة Q5 للتطفير الموجه للموقع لإدخال طفرات مفردة. كيف يُمكنني إدخال طفرات متعددة؟ ج: طوّرت NEB® بروتوكولًا باستخدام مزيج التجميع الرئيسي للحمض النووي NEBuilder HiFi لتبسيط عملية بناء الطفرات الموجهة للموقع المتعددة. تتضمن هذه التقنية تصميم بادئات جانبية مُكمّلة لمحاذاة القطع. توضح هذه المذكرة التطبيقية استخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتوليد طفرات موجهة متعددة في وقت واحد. نوصي بتداخل يتراوح بين 18 و20 نيوكليوتيدًا، ولكن يمكن تغيير طول البادئات. تتداخل البادئات تمامًا كما هو موضح أدناه. الهدف هو تحقيق توازن في قيم Ta لأزواج البادئات. تقع الطفرات في منتصف البادئة. يجب أن يكون هناك عدد كافٍ من القواعد على كلا الجانبين، والأهم من ذلك، في الطرف 3' من الطفرة، حتى ترتبط البادئة بشكل صحيح بالقالب.