نيو إنجلاند بيولابس، E2623S، مجموعة تجميع الحمض النووي NEBuilder® HiFi للقطع الكبيرة

تمت إعادة صياغة مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix بمكونات تحتوي على الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10238675. الفئات ذات الصلة: مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات. التطبيقات: مواصفات NEBuilder® HiFi DNA Assembly. المواد المطلوبة (غير متوفرة): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: لست متأكدًا مما إذا كان عليّ اختيار NEBuilder HiFi DNA Assembly أو NEB Gibson Assembly؟ ما الفرق بين المنتجين؟ ج: يوفر NEBuilder HiFi DNA Assembly العديد من المزايا مقارنةً بـ NEB Gibson Assembly. يستخدم NEBuilder HiFi بوليميرازًا عالي الدقة خاصًا به، مما يقلل من الحاجة إلى فحص/إعادة تسلسل التركيبات، ويضمن تجميعًا عالي الدقة وخاليًا من الأخطاء تقريبًا. تُمكّن هذه الميزة أيضًا من استخدام NEBuilder في تطبيقات مُحددة لا يُمكن استخدام NEB Gibson Assembly فيها: إذ يُزيل NEBuilder HiFi عدم تطابق النهايات 5' و3'، ويُمكن استخدامه في جولات تجميع مُتتالية. يُوفر هذا الوقت بتجنب خطوات تضخيم PCR المُستهلكة للوقت. يُمكن لـ NEBuilder HiFi ربط قطعتين من الحمض النووي المزدوج باستخدام قليل نيوكليوتيدات الحمض النووي أحادي السلسلة الاصطناعي لإنشاء بسيط وسريع (مثل إدخال رابط أو مكتبة gRNA). لمزيد من المعلومات والبيانات التفصيلية، يُرجى زيارة NEBuilderHifi.com. س: ما هي مزايا هذه الطريقة مُقارنةً بطرق الاستنساخ التقليدية؟ ج: يسمح تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi بإدخال قطعة واحدة أو أكثر من الحمض النووي في أي موضع تقريبًا من الناقل الخطي، ولا يعتمد على وجود مواقع تقييد ضمن تسلسل مُعين. لذلك، يتمتع المُستخدم بتحكم كامل في ما يتم تجميعه، ويُمكن تجنب إدخال تسلسل إضافي غير مرغوب فيه، والذي يُستخدم غالبًا لتسهيل مُعالجة تسلسلات الحمض النووي المُتعددة. علاوة على ذلك، تتميز طريقة تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi بالسرعة مقارنةً بالاستنساخ التقليدي باستخدام إنزيمات التقييد. وأخيرًا، يمكن ربط عدد أكبر من شظايا الحمض النووي في تفاعل واحد بكفاءة أعلى من الطرق التقليدية. س: ما هي أكبر شظية مفردة تم تجميعها باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تم استخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لاستنساخ بنية بطول 22.7 كيلوبايت. بالنسبة للمنتجات المُجمَّعة التي يزيد طولها عن 15 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Competent E. coli (عالية الكفاءة، NEB #C3019) والمُدرجة في حزمة NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle للشظايا الكبيرة (NEB #E2623). بدلاً من ذلك، يمكنك استخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB #C3020). س: كم عدد شظايا الحمض النووي التي يمكن تجميعها في تفاعل واحد؟ ج: يعتمد عدد قطع الحمض النووي التي يمكن تجميعها في تفاعل واحد على طول القطع وتسلسلها. وقد استُخدم مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتجميع ما يصل إلى إحدى عشرة قطعة، طول كل منها 0.4 كيلوبايت، بكفاءة في ناقل واحد في المرة الواحدة. مع ذلك، نوصي بتجميع خمس قطع أو أقل في ناقل واحد في تفاعل واحد، لإنتاج نسخة مستنسخة تحتوي على القطعة الصحيحة. يمكن استخدام استراتيجية التجميع المتسلسل إذا تعذر تجميع جميع القطع في تفاعل واحد. بدلاً من ذلك، يمكن النظر في تجميع Golden Gate لتجميع أكثر من 6 قطع. س: ما أقصر مناطق التداخل التي يمكن استخدامها مع طريقة التجميع هذه؟ ج: تم تحقيق تجميع فعال لقطع الحمض النووي بتداخل لا يقل عن 12 زوجًا قاعديًا، ولكن ذلك يعتمد على محتوى GC في منطقة التداخل. نوصي باستخدام تداخلات لا تقل عن 15 زوجًا قاعديًا، أو أكثر، لتجميع الحمض النووي المزدوج (dsDNA) عند درجة انصهار (Tm) ≥ 48 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجات مئوية). كما أن زيادة طول التداخل بين القطع يقلل من كمية الحمض النووي اللازمة للتجميع. س: هل يمكن تجميع قطع الحمض النووي المزدوج (dsDNA) التي يبلغ طولها ≤ 200 زوج قاعدي بهذه الطريقة؟ ج: نعم. للحصول على أفضل النتائج، استخدم هذه القطع بزيادة ≥ 5 أضعاف. س: هل يمكن تجميع العديد من قليل النوكليوتيدات أحادية السلسلة (ssDNA) مع قطع الحمض النووي المزدوج (dsDNA)؟ ج: نعم. ومع ذلك، يجب تحديد التركيز الأمثل لكل قليل نيوكليوتيد. كنقطة بداية، نوصي باستخدام 45 نانومول من كل قليل نيوكليوتيد، بحيث يكون أقل من أو يساوي اثني عشر قليل نيوكليوتيدًا مكونًا من 60 قاعدة تحتوي على تداخلات 30 قاعدة. للحصول على مزيد من المعلومات، يُرجى تنزيل مذكرة التطبيق بعنوان: "بناء ناقل تعبير sgRNA-Cas9 عبر ربط قطع DNA مزدوجة السلسلة بواسطة أوليغونوكليوتيدات DNA أحادية السلسلة". س: هل يمكن استخدام فترات حضانة أطول أو أقصر؟ ج: نعم. لتجميع 2-3 قطع، تكفي فترة حضانة 15 دقيقة. لتجميع 4-6 قطع، يُوصى بفترة حضانة 60 دقيقة. لا يُوصى عمومًا بفترات تفاعل أقل من 15 دقيقة. وقد ثبت أن فترات الحضانة الممتدة (حتى 4 ساعات) تُحسّن كفاءة التجميع في بعض الحالات. لا تُحضن التفاعل طوال الليل. س: هل سيعمل التفاعل عند درجات حرارة أخرى؟ ج: تم تحسين التفاعل عند 50 درجة مئوية، ولكن ثبت أنه يعمل بين 40 و50 درجة مئوية. س: هل من الضروري تنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عند إجراء تجميعات DNA باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix أو مزيج Gibson Assembly Master Mix؟ ج: لا داعي لتنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بشكل عام. يمكنك استخدام نواتج PCR غير المنقاة مباشرةً، طالما أن حجمها الإجمالي في تفاعل التجميع لا يتجاوز 20%. في حال استخدام كميات أكبر من نواتج PCR، نوصي باستخدام مجموعة تنقية تعتمد على الأعمدة (مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup Kit، NEB #T1030). في حال تضخيم عدة أجزاء أو ملاحظة وجود ثنائيات البادئات، نوصي بتحسين خطوة PCR للحصول على أفضل النتائج. س: هل من الضروري تعطيل إنزيمات التقييد بعد هضم الناقل؟ ج: لا داعي لتعطيل إنزيمات التقييد بشكل عام، ولكن في بعض الحالات قد يزيد من كفاءة التحويل. إذا كان الجزء المُدخل والمنتج النهائي المُجمّع يحملان موقع التقييد المستخدم لتخطيط الناقل، فمن الضروري تعطيل إنزيم التقييد بالحرارة أو تنقية الناقل المقطوع إذا لم يكن التعطيل بالحرارة ممكنًا. س: أرغب في إنتاج أجزاء متداخلة من الحمض النووي المزدوج (dsDNA) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). س: هل أحتاج إلى استخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي تم تنقيتها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية منزوعة الأملاح. س: أرغب في تجميع قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة (ssDNA) لتكوين شظايا من الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). هل أحتاج إلى استخدام قليل النوكليوتيدات التي تم تنقيتها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية منزوعة الأملاح. لمزيد من المعلومات، يُرجى تنزيل مذكرة التطبيق بعنوان: "بناء ناقل تعبير sgRNA-Cas9 عبر ربط قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة بشظايا الحمض النووي ثنائي السلسلة". س: هل يمكنني تضخيم المنتج المُجمَّع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: نعم. يرتبط جزيء الحمض النووي المُجمَّع تساهميًا، ويمكن تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المنتج النهائي جزيء حمض نووي دائري مغلق، فيمكن استخدامه كقالب في تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). س: ماذا أفعل إذا لم ينتج عن تفاعل التجميع أي مستعمرات، أو عدد قليل منها، أو مستنسخات ذات حجم إدخال غير صحيح بعد التحويل إلى بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: قم بتجميع وتحويل عينة التحكم الموجبة المرفقة مع مجموعة NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/Cloning Kit. سيُظهر التجميع الناجح لعينة التحكم الموجبة أن خليط التجميع فعال وأن ظروف التحويل مناسبة. حلل التفاعل على هلام الأغاروز. سيُظهر تفاعل التجميع الفعال منتجات مُجمّعة بالحجم الصحيح واختفاء الشظايا. تحقق من تصميم البادئات لشظايا الحمض النووي المتداخلة للتأكد من وجود تداخل كافٍ لتسهيل التجميع. ضع في اعتبارك ما إذا كان الإدخال المستنسخ سامًا لبكتيريا الإشريكية القولونية، وفي هذه الحالة، يجب استخدام ناقل منخفض النسخ، مثل BAC. س: كيف يُمكنني تقليل عدد مستعمرات الخلفية الناتجة عن الناقل فقط؟ ج: لتقليل مستعمرات الخلفية غير المرغوب فيها الناتجة عن الناقل فقط بشكل كبير، يجب أن يكون الناقل ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بدلاً من شظية تقييد. إذا استمرت مشكلة الخلفية، يمكن معالجة الناقل المُضخّم بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام إنزيم DpnI لإزالة بقايا القالب، إن وُجدت، والمستخرجة من هلام الأغاروز بعد الفصل الكهربائي. س: هل يُمكنني استخدام التحويل الكهربائي بدلًا من التحويل الكيميائي؟ ج: نعم، ولكن من الضروري تخفيف ناتج تفاعل تجميع جيبسون ثلاث مرات، واستخدام 1 ميكرولتر فقط للتحويل الكهربائي. ملاحظة: الخلايا المُرفقة بهذه المجموعة مُؤهلة كيميائيًا. س: هل هناك أي اختلافات بين متطلبات تجميع 2-3 قطع مقابل 4 قطع أو أكثر؟ ج: الاختلافات الرئيسية بينهما هي طول التسلسلات المتداخلة بين القطع المتجاورة ووقت حضانة تفاعل التجميع. يُوصى ببروتوكول تفاعل التجميع لمدة 15 دقيقة لتجميع 2-3 قطع محاطة بتداخلات من 15-20 نيوكليوتيد. يُوصى ببروتوكول التجميع لمدة ساعة واحدة لتجميع 4 قطع أو أكثر، محاطة بتداخلات من 20-30 نيوكليوتيد. س: هل يمكنني استخدام ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُضخّم بواسطة بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: نعم. ستُزال قاعدة الأدينين الإضافية في الطرف 3' لناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء تجميع الحمض النووي إذا أصبحت قاعدة غير متطابقة بعد ارتباط القطع. س: هل يمكنني استخدام أدوات تصميم البادئات الأخرى، مثل SnapGene لتجميع جيبسون، لتصميم بادئات لتجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi؟ ج: قواعد تصميم البادئات متشابهة لكل من تجميع جيبسون وتجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi. أي بادئة مصممة لتجميع جيبسون ستعمل مع NEBuilder HiFi. مع ذلك، قد لا تعمل بعض البادئات التي تعمل مع NEBuilder HiFi مع جيبسون، لأنه على عكس مزيج جيبسون الرئيسي، يمكن لمزيج NEBuilder HiFi الرئيسي إزالة عدم تطابق الطرف 3'. قد لا تسمح الأدوات التي تصمم بادئات "جيبسون" بتصميم بادئات تستفيد من هذه الخاصية في NEBuilder HiFi. على الرغم من إمكانية استخدام أدوات أخرى، توصي NEB باستخدام أداتنا المجانية، NEBuilder Assembly Tool، لأنها تُتيح تصميم بادئات تراعي نهايات النواقل الناتجة عن هضم إنزيمات التقييد. س: هل توجد أي اختلافات بين NEBuilder HIFi DNA Assembly Master Mix، وNEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit، وNEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments؟ ج: NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix هو نفسه في جميع المنتجات. تتضمن NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit بكتيريا E. coli المُؤهلة كيميائيًا من NEB 5-alpha. أما NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments فتتضمن عبوتين من NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621S) وعلبة واحدة من بكتيريا E. coli المُؤهلة كيميائيًا من NEB 10-Beta (20 × 50 ميكرولتر). س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix؟ ج: تتوافق تركيبات الحمض النووي الناتجة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي شركة NEB باستخدام خلايا NEB 5-alpha المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كان حجم المنتجات المُجمّعة أكبر من 15 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام خلايا NEB 10-beta المؤهلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو خلايا NEB 10-beta المؤهلة كهربائيًا (NEB #C3020). إذا احتوت الجينات المُجمّعة على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام خلايا NEB Stable المؤهلة (NEB #C3040). يتوفر مزيج NEBuilder HiFi DNA Assemble Master Mix وبكتيريا E. coli المؤهلة من نوع NEB 5-alpha معًا في مجموعة استنساخ تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi (NEB #E5520). كما يتوفر مزيج NEBuilder HiFi وبكتيريا E. coli المؤهلة من نوع NEB 10-beta معًا في حزمة تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi للقطع الكبيرة (NEB #E2623). س: هل يمكنني استخدام تداخل بطول 15 نيوكليوتيدًا يتكون بالكامل من تكرارات علامة الهيستيدين (مثل CACCACCACCACCAC)؟ ج: لا، يجب أن تحيط بتسلسل علامة الهيستيدين من كلا الجانبين بنيوكليوتيدين على الأقل ليسا جزءًا من تسلسل علامة الهيستيدين المتكرر. بدلاً من ذلك، يمكنك إدخال كودونات الهيستيدين CAC وCAT لقطع هذا التسلسل المتكرر. يجب تجنب التسلسلات المتكررة في نهاية التداخل. س: هل هذه الطريقة قابلة للتطبيق على تجميع التسلسلات المتكررة؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب التأكد من احتواء كل قطعة من الحمض النووي على تداخل فريد لضمان التصاق التسلسلات وترتيبها بشكل صحيح. يمكن أيضًا دمج التسلسل المتكرر في المرحلة الأولى من استراتيجية التجميع ثنائية المراحل. إذا كان وجود تسلسلات متكررة في نهايات كل قطعة أمرًا لا مفر منه، فقد يتم إنتاج تجميع الحمض النووي الصحيح، وإن كان بكفاءة أقل من التجميعات الأخرى غير المقصودة. بدلاً من ذلك، يُنصح باستخدام تجميع Golden Gate للتجميعات التي تحتوي على تسلسلات متكررة. س: ما الفرق بين مجموعة NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/DNA Assembly Cloning kit/Bundle for Large Fragments ومجموعة NEB Gibson Assembly Master Mix/Cloning Kit الحالية؟ ج: تستخدم مجموعة NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix بوليميراز عالي الدقة. على الرغم من تشابه بروتوكولات هذه المجموعات، إلا أن المنتجات المُجمَّعة من مجموعتي NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix وNEBuilder HiFi Cloning Kit ستؤدي عادةً إلى عدد أكبر من المستعمرات. عند الحاجة إلى تجميع قطع DNA كبيرة (> 10 كيلوبايت) أو قطع متعددة (4+)، فإن زيادة منطقة التداخل إلى 30 زوجًا قاعديًا تُحسّن كفاءة التجميع والتحويل. كما لا توجد رسوم ترخيص مطلوبة من شركة NEB لمنتجات NEBuilder. س: هل يمكن لمزيج التجميع الرئيسي NEBuilder® HiFi DNA Assembly إزالة عدم تطابق النهايتين 3′ و5′؟ ج: نعم، يمكن لـ NEB HiFi إزالة عدم التطابق هذه حتى 10 أزواج قاعدية من النهاية، مما يسمح لأطراف DNA بالالتحام دون بروز. س: كيف يتم تحضير القطع للتجميع باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: يمكن تحضير القطع بالطرق التالية: يمكن تنظيف القطع الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عمود Monarch PCR أو مجموعة Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit إذا كانت نقاوة المُضخّم أكبر من 95%. إذا تم استخدام DNA البلازميد كقالب أثناء تفاعل PCR، فيمكن إزالته بمعالجة DpnI إذا لزم الأمر. في حال ظهور حزم متعددة، نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). إذا تعذر ذلك، يُنصح بتنقية الجل. قد يؤدي استخلاص الجل إلى إدخال غوانيدين ثيوسيانات (من محلول الإذابة) مما قد يقلل من كفاءة تفاعل التجميع. لتقليل هذا التلوث، يُنصح بتقليم شريحة الجل بحيث يمكن استخدام كمية أقل من محلول إذابة الجل. يمكن إجراء هضم البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد، يليه تعطيله بالحرارة أو تنقيته باستخدام عمود الفصل. يمكن إعادة تعليق القطع المطلوبة تجاريًا في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول TE واستخدامها مباشرةً في تفاعل التجميع. س: أرغب في تصغير عملية تجميع الحمض النووي باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix وجهاز Labcyte Echo Liquid Handler. هل لديكم أي معلومات يمكنني الرجوع إليها لمساعدتي في أتمتة عملية تجميع الحمض النووي؟ ج: تتوفر المراجع التالية من شركة Labcyte: مذكرة تطبيقية: تجميع الحمض النووي متعدد القطع المصغر، مذكرة فنية: تجميع الحمض النووي المعياري لـ PIK3CA باستخدام النقل الصوتي السائل في أحجام نانولتر، مذكرة فنية: تجميع الحمض النووي على نطاق نانولتر باستخدام مجموعة استنساخ NEBuilder HiFi. س: كيف يؤثر طول التداخل على كفاءة تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi؟ ج: يزيد التداخل الأطول (20-30 زوجًا قاعديًا) من كفاءة التجميع. تم تجميع أربعة أجزاء (~20 فمول) بتداخل 15 أو 20 زوجًا قاعديًا باستخدام مزيج التجميع الرئيسي NEBuilder HiFi DNA (NEB #E2621) عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لإنشاء ناقل pUC19. تم تحويل 2 ميكرولتر من المزيج المُجمَّع إلى بكتيريا E. coli المؤهلة NEB 5-alpha (NEB #C2987) ونُشرت على طبق LB/Amp يحتوي على IPTG وX-gal. تم عد المستعمرات الزرقاء التي تشير إلى التجميع الصحيح. يُعدّ مزيج تجميع الحمض النووي NEBuilder HiFi أكثر كفاءةً عند استخدام تداخل 20 زوجًا قاعديًا مقارنةً بتداخل 15 زوجًا قاعديًا. س: ما هي مقاومة المضادات الحيوية المُشفّرة في عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder (عنصر التحكم في التجميع)؟ ج: عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder عبارة عن إدخال واحد في بلازميد pUC19 مقاوم للأمبيسيلين. إذا كان مزيج التجميع يعمل بشكل صحيح، فستحصل على مستعمرات على طبق أمبيسيلين باستخدام عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder.