نيو إنجلاند بيولابس، E3005L، مجموعة Luna® العالمية أحادية الخطوة RT-qPCR

الفئات ذات الصلة: Luna® qPCR وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تطبيقات تقنيات التضخيم وqPCR، qPCR وRT-qPCR القائم على الصبغة، qPCR وRT-qPCR، RT-qPCR ثنائي الخطوة، الأسئلة الشائعة : س: كيف أستخدم qPCR لتحديد تركيز المادة؟ ج: يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التألق في الوقت الحقيقي لقياس كمية الحمض النووي الموجودة في كل دورة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لتوليد إشارة فلورية، وأكثرها شيوعًا استخدام مجسات التحلل المائي (مثل TaqMan®)، أو صبغة ربط الحمض النووي ثنائي السلسلة (مثل SYBR® Green). عند النقطة التي يمكن فيها اكتشاف إشارة التألق لـ qPCR فوق تألق الخلفية، يمكن تحديد دورة التحديد الكمي، أو قيمة Cq. يمكن استخدام قيم Cq لتقييم الوفرة النسبية للهدف بين عينتين أو أكثر. بدلاً من ذلك، يمكن استخدامها لحساب الكميات المستهدفة المطلقة بالرجوع إلى منحنى معياري مناسب، مُستمد من سلسلة من تخفيفات الحمض النووي المعروفة. عادةً، يقوم برنامج جهاز qPCR بإجراء عمليات الرسم والحسابات اللازمة لتحديد التركيز. كما تتضمن أدوات NEB الإلكترونية حاسبة qPCR، والتي يمكن العثور عليها على الموقع NEBiocalculator.neb.com. س: هل يمكنني إعداد جهاز Luna® RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم. يمكن إعداد جهاز Luna RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة، ولكن للحصول على أفضل النتائج، يجب حفظ التفاعلات على الجليد قبل دورات التسخين والتبريد. يتم التحكم في كلا الإنزيمين الموجودين في المجموعة، وهما Hot Start Taq DNA Polymerase و WarmStart® Luna Reverse Transcriptase، بواسطة مثبطات عكسية حساسة للحرارة (SOMAmer®). تعمل هذه المثبطات على تثبيط نشاط البوليميراز عند درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية، مما يمنع النشاط غير المرغوب فيه وغير المحدد حتى يتم تسخين التفاعل فوق درجة حرارة الإطلاق أثناء خطوة النسخ العكسي. س: ما الفرق بين نسخ مزيج Luna® qPCR المعتمدة على المجسات والصبغات؟ ج: يُقاس تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) عادةً بإحدى طريقتين: إما باستخدام صبغة متداخلة تُصدر فلورة أقوى عند ارتباطها بالحمض النووي المزدوج، أو باستخدام أوليغونوكليوتيد "مجس" موسوم بفلورة يرتبط بتسلسل محدد في ناتج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويتم منع الفلورة الخلفية للمجس بوجود مجموعة مثبطة. في حالة مجسات التحلل المائي، يتم فصل المثبط عن الفلوروفور أثناء التضخيم بواسطة نشاط النيوكلياز 5´→3´ لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq. ولتمكين الكشف المعتمد على الصبغات، يحتوي مزيج Luna Universal qPCR على صبغة متداخلة يتم الكشف عنها في قناة SYBR® Green أو FAM لمعظم أجهزة الوقت الحقيقي. لا تحتوي منتجات Luna Universal Probe qPCR على صبغة ربط الحمض النووي المزدوج (لأنها ستتداخل مع استخدام المجسات الموسومة بـ FAM). يجب على المستخدمين إضافة مجس أوليغونوكليوتيد موسوم إلى المزيج، بالإضافة إلى بادئات PCR الأمامية والخلفية. يُرجى ملاحظة أن صبغة المرجع السلبية الموجودة في كلا المزيجين لا تتداخل مع استخدام المجسات الموسومة بـ ROX. س: هل يجب عليّ استخدام الكشف القائم على المجسات أم الكشف القائم على الصبغة في فحوصات qPCR؟ ج: يتطلب الكشف القائم على الصبغة (مثل SYBR® Green) إضافة بادئات PCR فقط، مما يجعله خيارًا اقتصاديًا لـ qPCR. مع ذلك، ستكشف الصبغة المتداخلة عن أي حمض نووي مزدوج السلسلة (dsDNA) ينتج في التفاعل. لذلك، قد يُلاحظ تضخيم خارج الهدف أو تضخيم غير مرتبط بالقالب (NTC) لبعض مجموعات البادئات، مما يؤدي إلى قياس كمي غير دقيق. يمكن استخدام منحنيات التمسخ (الذوبان) التي تُجرى بعد تفاعل PCR للتمييز بين المنتجات الصحيحة وغير النوعية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن قياس سوى مُضخَّم واحد في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) القائم على الصبغة، دون إمكانية إجراء تفاعلات متعددة. يتطلب الكشف القائم على المجسات تصميمَ والحصولَ على مجس أوليغونوكليوتيد مُوسَم بفلوروفور مُحدد التسلسل، بالإضافة إلى بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية. هذا يزيد من تكاليف التحليل، لكن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائمة على المجسات تتميز بدقة عالية للغاية، ومن غير المرجح أن تؤدي إلى قياس كمي غير دقيق بسبب تضخيم NTC. تُصبح التفاعلات المتعددة ممكنة باستخدام المجسات، حيث يمكن تصميم مُضخَّمات مختلفة باستخدام فلوروفورات فريدة وفقًا للإمكانيات البصرية لجهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. س: كيف يُمكنني تصميم البادئات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Luna®؟ ج: نوصي باستخدام برنامج تصميم البادئات (مثل Primer3) لاختيار تسلسلات الهدف والبادئات لزيادة كفاءة التضخيم إلى أقصى حد مع تقليل التضخيم غير المحدد وثنائيات البادئات. يتوافق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Luna أيضًا مع فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتوفرة تجاريًا. عند تصميم البادئات يدويًا، ننصح بتصميم مُضخّمات قصيرة (من 70 إلى 200 زوج قاعدي) ذات محتوى GC متوازن (40-60%). استهدف درجة حرارة انصهار (Tm) تقارب 60 درجة مئوية باستخدام إعدادات Hot Start Taq في حاسبة Tm من NEB (TmCalculator.neb.com). بالنسبة لأهداف cDNA وRNA، يُنصح بتصميم البادئات عبر مواقع الربط المعروفة (وصلات الإكسون-إكسون) لمنع التضخيم من الحمض النووي الجينومي. س: ما هو طول المُضخّم المناسب لتفاعل qPCR؟ ج: من العوامل المهمة في تجربة qPCR زيادة كفاءة تضخيم PCR، وتساعد المُضخّمات القصيرة على ضمان كفاءة عالية. يتراوح طول مُضخّمات qPCR النموذجية بين 70 و200 زوج قاعدي، ونوصي بتصميم هدفك ضمن هذا النطاق. يمكن استخدام مُضخّمات أطول، ولكن قد يتطلب ذلك تحسينًا (مثل زيادة أوقات التمديد). س: لماذا لون مزيج Luna® qPCR أزرق؟ هل يؤثر هذا الصبغ على عملية الكشف؟ ج: يحتوي مزيج Luna® qPCR على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُعطي المزيج لونًا أزرقًا واضحًا. يُسهّل هذا اللون تحديد الآبار التي تم تحميلها بالكواشف في لوحة qPCR، وهو أمر قد يكون صعبًا نظرًا لصغر حجم الآبار وطبيعة العديد من لوحات qPCR ذات 96 و384 بئرًا غير الشفافة. خضعت الصبغة الزرقاء لتقييمات مكثفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وqPCR، وهي لا تُعيق أو تتداخل مع عملية الكشف في qPCR. س: هل يُمكنني تشغيل مزيج Luna® qPCR على جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: تحتوي مزيجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية عالمية تُتيح التوافق مع مجموعة واسعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم صبغة مرجعية سلبية للتطبيع (مثل Bio-Rad® CFX)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية منخفضة التركيز (مثل Applied Biosystems® 7500 أو QuantStudio®)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية عالية التركيز (مثل Applied Biosystems 7900 أو StepOne®). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001). تفتقر مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مزيج Luna مع ظروف دورات قياسية أو سريعة. س: هل يمكنني استخدام إعدادات الجهاز السريعة مع مزيج Luna® qPCR؟ ج: يتوافق مزيج Luna qPCR مع سرعات التسخين السريعة والقياسية على الأجهزة التي تدعم كلا السرعتين. نوصي بدرجات حرارة وأوقات دورات محددة (راجع البروتوكول أو الدليل لمزيد من المعلومات)، ولكن يمكن استخدام أي من إعدادات التسخين مع ظروف الدورات هذه. (ملاحظة: يجب التحقق من ظروف الدورات بعد تغيير إعداد سرعة التسخين؛ في بعض أجهزة الوقت الحقيقي، سيؤدي تغيير سرعة التسخين أيضًا إلى إعادة ظروف الدورات إلى الإعداد الافتراضي للجهاز). س: هل أحتاج إلى إضافة ROX؟ ج: توصي بعض أجهزة الوقت الحقيقي باستخدام صبغة مرجعية سلبية (عادةً ROX) للتغلب على الاختلافات بين الآبار التي قد تنتج عن قيود الجهاز مثل "تأثير الحافة" والفقاعات والاختلافات الطفيفة في الحجم والتألق الذاتي من الغبار أو الجسيمات في التفاعل. مع ذلك، لا يُسهم توحيد ROX إلا ​​قليلاً في معالجة التباينات الناتجة عن أخطاء سحب القوالب/البادئات، والخلط غير المتجانس، ومشاكل التبخر/التكثيف. تحتوي منتجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية شاملة تُمكّن من التوافق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم توحيدًا مرجعيًا سلبيًا وتلك التي تستخدم كمية منخفضة أو عالية من الصبغة المرجعية السلبية (ROX). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) تفتقر إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR): Bio-Rad® iQ™5، CFX96، CFX384، Opticon، Roche Lightcycler®، Qiagen Rotor-Gene™، Eppendorf Mastercycler®، Cepheid® SmartCycler®. غير موصى به/مطلوب: Applied Biosystems® 7500، 7500 Fast، QuantStudio™، ViiA7™، Agilent Mx™. تركيز منخفض من ROX (~50 نانومتر نهائي). Applied Biosystems® 5700، 7000، 7300، 7700، 7900، 7900HT، 7900HT Fast، StepOne™، StepOnePlus™. تركيز عالٍ من ROX (~500 نانومتر نهائي). س: كم عدد التخفيفات التي يجب استخدامها لإنشاء منحنى قياسي؟ ج: تتضمن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) النموذجية معايير تغطي خمسة رتب مقدارية (خمسة تخفيفات متسلسلة عشرية) لإنشاء منحنى معياري. اختر أقل كمية معيارية تمثل نسخة واحدة تقريبًا من الهدف عند الرغبة في الحصول على أقصى حساسية. يمكن زيادة أو تقليل عدد النقاط على المنحنى المعياري حسب الرغبة، ويمكن استخدام ثلاث نقاط فقط عندما يكون الهدف والفحص والعينة موصوفة جيدًا. س: لماذا توصي NEB بـ 40-45 دورة؟ ج: تضخيم 40 دورة كافٍ للأهداف ذات النسخ العالية، أو عند استخدام فحص موصوف جيدًا حيث لا يمثل تضخيم غير القالب مصدر قلق. نقترح 45 دورة لزيادة الثقة في الكشف عن الأهداف ذات النسخ المنخفضة إلى نسخة واحدة. قد تساعد الدورات الإضافية أيضًا في الكشف عن التضخيم غير المحدد لمجموعة بادئات معينة عند استخدام مخاليط qPCR القائمة على الصبغة. س: هل يحتوي مزيج Luna® qPCR على dUTP؟ هل يمكنني استخدام طرق منع التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج Luna qPCR باستخدام مزيج من dTTP وdUTP. يضمن هذا تضخيمًا فعالًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالإضافة إلى دمج dU في المنتجات أثناء تفاعل qPCR. تعمل منتجات qPCR التي تحتوي على dU كركيزة لإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز، مما يسمح بمنع التلوث العابر. إذا كان الهدف من التضخيم هو الاستخدام الروتيني، أو إذا كان سيتم فتح أوعية qPCR، أو إذا كان من المرغوب فيه تجنب التلوث العابر، فيمكن إضافة 0.025 وحدة/ميكرولتر من إنزيم Antarctic Thermolabile UDG (NEB #M0372) إلى مزيج التفاعل. عند إضافة إنزيم Antarctic Thermolabile UDG، قم بإعداد تجارب qPCR في درجة حرارة الغرفة أو أضف خطوة حضانة إضافية لمدة دقيقتين عند 25 درجة مئوية قبل ظروف التدوير الافتراضية. س: لماذا تظهر لديّ قمم متعددة في منحنى الذوبان؟ أ: عادةً ما يُظهر منحنى التمسخ (الذوبان) النموذجي، الذي يُجرى بعد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام صبغة متداخلة، قمةً واحدةً واضحةً في رسم المشتق السالب للفلورة مقابل درجة الحرارة. يشير هذا إلى أن منتجات الحمض النووي المزدوج المُضخّمة هي نوع واحد منفصل. قد يؤدي وجود أنواع متعددة من الحمض النووي في نفس التفاعل إلى ظهور قمم متعددة في منحنى الذوبان، مما يشير عادةً إلى وجود منتجات تضخيم ملوثة أو غير مستهدفة. ابحث في بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مقابل تسلسل الحمض النووي المُدخل لتحديد ما إذا كان من الممكن تضخيم منتج آخر غير الهدف المطلوب، على سبيل المثال، بسبب تشابه التسلسل أو وجود أشكال متعددة لنفس تسلسل الجين. أعد تصميم البادئات إذا لزم الأمر. في بعض الأحيان، وبسبب خصائص خاصة بالتسلسل و/أو محتوى GC، ستشهد بعض منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) انتقالات ذوبان متعددة المراحل، مما يؤدي إلى ظهور منحنى ذوبان بقمم متعددة. يمكن اعتبار هذه الأنواع من المنتجات بمثابة تفاعل بوليميراز متسلسل كمي (qPCR) ناجح. يمكن التنبؤ بملف تعريف الذوبان لأي تسلسل ذي أهمية باستخدام أداة uMelt عبر الإنترنت. س: كيف يمكنني التمييز بين التضخيم غير المعتمد على القالب (NTC) والمنتجات الحقيقية؟ ج: أبسط طريقة لمعرفة ما إذا كان التضخيم غير المعتمد على القالب يحدث ويؤثر على دقة القياس الكمي هي تضمين تفاعلات تحكم تحتوي على البادئات المطلوبة ولكن بدون المدخلات المستهدفة (مع إضافة محلول منظم أو ماء فقط بدلاً منها). قد تُنتج تفاعلات التحكم غير المعتمدة على القالب (NTC) هذه منتجات تضخيم، والتي عادةً ما تكون ذات حجم و/أو محتوى تسلسلي مختلف عن منتج الحمض النووي المطلوب، وبالتالي ستتفكك بملف انصهار مختلف. يمكن أن تُمكّن مقارنة منحنيات الانصهار من التفاعلات المختلفة من الكشف عن أي تضخيم غير معتمد على القالب. يجب إزالة أي تفاعلات تُظهر ملف انصهار مشابهًا لـ NTC من منحنى المعايرة وحسابات القياس الكمي. س: لماذا أرى منحنيات تضخيم في عينات NTC الخاصة بي؟ ج: يمكن أن تظهر المنتجات في آبار التحكم غير المعتمد على القالب (NTC) نظرًا لقدرة بعض تسلسلات البادئات على تكوين هياكل يمكن استخدامها كركائز بواسطة بوليميرازات الحمض النووي. يُعدّ "ثنائي البادئ" الشكل الأكثر شيوعًا لهذه المشكلة، حيث تسمح بعض مناطق التكامل الصغيرة في بادئَي تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بإنتاج بنية قابلة للتضخيم. تهدف العديد من أدوات تصميم البادئات إلى القضاء على هذه الإمكانية، وضمان عدم قدرة أي بادئ على تكوين بنية ثانوية ضمن تسلسله. يمكن تمييز هذا النوع من التضخيم من خلال تقييم منحنيات الذوبان، حيث ينتج عن ثنائي البادئ أو التضخيم غير النوعي منتجات DNA ذات قمة ذوبان مختلفة عن قمة ذوبان منتج qPCR الصحيح. تفسير آخر للتضخيم في آبار التحكم السلبي (NTC) هو وجود منتجات PCR ملوثة تم تضخيمها في تجارب qPCR سابقة. يُعدّ هذا مصدر قلق كبير عند استخدام نفس التحليل بشكل متكرر، وخاصةً عند فتح أوعية التفاعل بعد اكتمال تفاعل qPCR. يمكن تجنب هذه المشكلة باتباع إجراءات تعقيم عامة، مثل عدم فتح الأوعية بعد التفاعلات أو القيام بذلك في مختبر فرعي بمعدات منفصلة، ​​بالإضافة إلى التطهير الروتيني للمختبر ومعداته. يمكن استخدام منحنيات الذوبان لتحديد ما إذا كان تضخيم NTC ناتجًا عن تلوث متبقٍ. في هذه الحالة، ستكون نواتج تفاعلات NTC من نفس نوع الهدف المقصود، وستتطابق منحنيات الذوبان تبعًا لذلك. في حال اكتشاف تلوث، يجب استبدال جميع الكواشف (البادئات، الماء، مزيج qPCR)، وتطهير المعدات بمحلول مبيض بنسبة 10%، واتباع إجراءات معقمة في التجارب اللاحقة. يمكن استخدام 0.2 وحدة/ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي (NEB #M0372) للمساعدة في الحد من التلوث المتبقٍ في الحالات التي يمثل فيها مشكلة مستمرة أو في التطبيقات الحساسة للغاية. س: ما كمية البادئ التي يجب استخدامها مع مجموعة Luna® Universal RT-qPCR؟ ج: بالنسبة لمعظم الأهداف، يوفر تركيز نهائي قدره 400 نانومتر لكل بادئ الأداء الأمثل. عند الحاجة، يمكن تحسين التركيز النهائي للبادئ بين 100 و900 نانومتر. س: كيف أختار بين تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة وتقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة؟ ج: تتوفر طريقتان لتحديد كمية عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA): تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة وتقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة. في كلتا الحالتين، يُنسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) عكسيًا إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA)، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم الحمض النووي الريبوزي الكمي (qPCR). يمكن إجراء النسخ العكسي بشكل منفصل عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (أي تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة) أو مباشرةً في مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (أي تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة). تُفضل عادةً إجراءات العمل أحادية الخطوة في فحوص التشخيص الجزيئي. تُفضل تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة عند إجراء تحليلات متعددة لنفس المادة الأولية أو عند الحاجة إلى أرشفة الحمض النووي التكميلي (cDNA). لمزيد من التفاصيل، يُرجى الرجوع إلى "اختيار تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة أو تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة". س: ما هي عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يمكن استخدامها في تقنية RT-qPCR مع مزيج Luna®؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخلاص أو تنقية مادة الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأولية. تعمل مجموعة Luna RT-qPCR مع الأحماض النووية من أنواع مختلفة من العينات المنقاة باستخدام الطرق التقليدية القائمة على الأعمدة (مثل مجموعة Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010)). عند إجراء الدراسات باستخدام مزارع الخلايا الثديية، يمكن إضافة مستخلصات الخلايا الناتجة عن وحدة Luna Cell Ready Lysis Module (NEB #E3032) إلى جميع كواشف Luna أحادية الخطوة RT-qPCR. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت العديد من الدراسات بشكل مباشر توافق كواشف Luna مع اللعاب وعينات أخرى ذات صلة سريرية باستخدام بروتوكولات تحضير العينات الأولية. SalivaDirect مثال على ذلك. س: ما كمية قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يجب استخدامها في تفاعل RT-qPCR؟ ج: تعمل مجموعة Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit بشكل جيد مع قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقاة، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA) والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) وعينات النسخ المختبرية. الكمية في تفاعل 20 ميكرولتر: إجمالي الحمض النووي الريبي ≤ 1 ميكروغرام، الحمض النووي الريبي متعدد الأدينين ≤ 0.1 ميكروغرام، النسخ المخبرية ≤ 10⁹ نسخة. س: هل يمكنني استخدام أهداف أطول في تفاعل RT-qPCR بخطوة واحدة؟ ج: بشكل عام، تميل المنتجات المضخمة الأصغر (70-200 زوج قاعدي) إلى تحقيق كفاءة أعلى وقيم عتبة أسرع. بالنسبة للأهداف في هذا النطاق الحجمي، يُوصى بوقت تمديد 30 ثانية. ستستفيد الأهداف الأطول من أوقات تمديد أطول، لكن الوقت الفعلي سيعتمد على طول الهدف ونوع الجهاز، ويجب تحديده تجريبيًا. س: ما هي درجة الحرارة التي يجب استخدامها لتخليق الحمض النووي المكمل باستخدام مجموعات Luna® RT-qPCR؟ ج: يدعم إنزيم النسخ العكسي Luna WarmStart® المقاوم للحرارة تخليق الحمض النووي المكمل بكفاءة في درجات حرارة مرتفعة مقارنةً بـ MMLV. بشكل عام، يمكن إنجاز تخليق الحمض النووي المكمل بحضانة لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. بالنسبة للقوالب المعقدة، يمكن رفع درجة حرارة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) إلى 60 درجة مئوية. س: هل يجب تضمين عينة تحكم خالية من إنزيم Luna® WarmStart® Enyzme Mix (عينة تحكم -RT)؟ ج: نعم. يشير التضخيم في غياب إنزيم النسخ العكسي في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) عمومًا إلى وجود حمض نووي ملوث في عينة الحمض النووي الريبوزي (RNA) المدخلة. معالجة عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام إنزيم DNase ستزيل أي حمض نووي قبل إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). س: ما هو الصبغ الفلوري المرتبط بالحمض النووي المزدوج في مزيج Luna® qPCR الرئيسي؟ ج: الصبغ الموجود في مزيج Luna® qPCR الرئيسي هو صبغة فلورية متداخلة ذات خصائص إثارة وانبعاث مشابهة لصبغة SYBR®. تتألق الصبغة بأقصى انبعاث عند حوالي 535 نانومتر عند ارتباطها بالحمض النووي المزدوج (الدوائر الخضراء)، ولكنها تُظهر تألقًا ضعيفًا في وجود الحمض النووي أحادي السلسلة أو في غياب الحمض النووي (المثلثات البرتقالية). لتمكين الكشف باستخدام الصبغة، اختر قناة SYBR Green أو FAM في معظم أجهزة التحليل الكمي في الوقت الحقيقي. س: هل مجموعة Monarch® Total RNA Miniprep Kit متوافقة مع كواشف Luna® RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بهذه المجموعات في تفاعل RT-qPCR مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. يُنتج تفاعل RT-qPCR للحمض النووي الريبوزي المُنقّى باستخدام Monarch من أنواع عينات مختلفة نتائج عالية الجودة باستمرار، مما يسمح بالقياس الكمي الدقيق والقابل للتكرار. ولإثبات جودة وفائدة Monarch Total RNA للقياس الكمي القائم على RT-qPCR، أُجريت 16 تجربة وتم تصويرها باستخدام طريقة "النقاط في المربعات" التي طُوّرت في NEB. تشمل كل تجربة ثلاث تفاعلات متكررة لنطاق خمسة لوغاريتمات من تركيزات القالب المُدخل وعينات تحكم بدون قالب (NTC) (18 تفاعلًا إجمالًا). تُعرَّف تجربة RT-qPCR عالية الجودة، والمُمثَّلة بنقطة داخل المربع، بأنها ذات كفاءة تتراوح بين 90 و110%، وقيمة ΔCq ≥ 3 (حيث ΔCq هو الفرق بين متوسط ​​قيمة Cq لعينة التحكم السلبية (NTC) وأقل قيمة مُدخلة)، ودرجة جودة ≥ 4 (بناءً على الخطية، وقابلية التكرار، وشكل المنحنى، ومعايير أخرى). استُخدمت بادئات تستهدف متغيرات GAPDH (في الجرذان والفئران والطماطم والخميرة)، ومتغيرات PGK (في الجرذان)، ومتغيرات β-actin (في الجرذان والفئران والطماطم) مع الحمض النووي الريبوزي الكلي المُستخلص من دماغ الجرذان وكبدها وكليتيها، وأوراق الطماطم، والخميرة كقوالب. جُمعت فحوصات RT-qPCR وفقًا للتعليمات باستخدام كواشف Luna RT-qPCR، وأُجريت دوراتها على جهاز Bio-Rad CFX384. يُنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) على الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بتقنية Monarch منحنيات qPCR عالية الجودة، مما يُظهر دقة القياس الكمي عبر مجموعة واسعة من أنواع العينات. تم تخفيف الحمض النووي الريبوزي المُنقّى بتقنية Monarch من دم الإنسان الكامل، وكلى الفئران، وأوراق الطماطم، وخميرة S. cerevisiae لإنتاج نطاق لوغاريتمي من تركيزات القالب المُدخل. استُخدمت بادئات تستهدف متغيرات GAPDH (الطماطم، الخميرة)، أو PGK (الفئران)، أو SMG1 (دم الإنسان) في فحوصات RT-qPCR، وتم تجميعها وفقًا للتعليمات باستخدام كواشف Luna RT-qPCR (NEB #E3005) وتم تدويرها على جهاز Bio-Rad CFX384. س: هل مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) بتقنية Monarch Spin متوافقة مع كواشف Luna RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بهذه المجموعات في تفاعل RT-qPCR مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. س: هل يمكنني استخدام أوقات حضانة أقصر؟ ج: نعم. بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن استخدام أوقات حضانة أقصر في كل خطوة. ومع ذلك، يُنصح باستخدام ظروف الحضانة القياسية كنقطة بداية، وقد تكون ضرورية للاختبارات الصعبة مثل تلك التي تتطلب كمية قليلة من الحمض النووي.