نيو إنجلاند بيولابس، E3006X، مجموعة Luna® Universal Probe One-Step RT-qPCR

تُقدم هذه المجموعة أيضًا ضمن الفئات ذات الصلة: Luna® qPCR وRT-qPCR، وPCR، وqPCR، وتقنيات التضخيم، وتطبيقات qPCR وRT-qPCR القائمة على المجسات، وqPCR وRT-qPCR، وRT-qPCR ثنائي الخطوات. الأسئلة الشائعة : س: كيف أستخدم qPCR لتحديد تركيز المادة؟ ج: يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التألق في الوقت الحقيقي لقياس كمية الحمض النووي الموجودة في كل دورة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. وقد طُوّرت مجموعة واسعة من الطرق لتوليد إشارة فلورية، وأكثرها شيوعًا استخدام مجسات التحلل المائي (مثل TaqMan®)، أو صبغة ربط الحمض النووي ثنائي السلسلة (مثل SYBR® Green). عند النقطة التي يمكن فيها اكتشاف إشارة التألق لـ qPCR فوق تألق الخلفية، يمكن تحديد دورة التحديد الكمي، أو قيمة Cq. يمكن استخدام قيم Cq لتقييم الوفرة النسبية للهدف بين عينتين أو أكثر. بدلاً من ذلك، يمكن استخدامها لحساب الكميات المستهدفة المطلقة بالرجوع إلى منحنى معياري مناسب، مُستمد من سلسلة من تخفيفات الحمض النووي المعروفة. عادةً، يقوم برنامج جهاز qPCR بإجراء عمليات الرسم والحسابات اللازمة لتحديد التركيز. كما تتضمن أدوات NEB الإلكترونية حاسبة qPCR، والتي يمكن العثور عليها على الموقع NEBiocalculator.neb.com. س: هل يمكنني إعداد جهاز Luna® RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم. يمكن إعداد جهاز Luna RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة، ولكن للحصول على أفضل النتائج، يجب حفظ التفاعلات على الجليد قبل دورات التسخين والتبريد. يتم التحكم في كلا الإنزيمين الموجودين في المجموعة، وهما Hot Start Taq DNA Polymerase و WarmStart® Luna Reverse Transcriptase، بواسطة مثبطات عكسية حساسة للحرارة (SOMAmer®). تعمل هذه المثبطات على تثبيط نشاط البوليميراز عند درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية، مما يمنع النشاط غير المرغوب فيه وغير المحدد حتى يتم تسخين التفاعل فوق درجة حرارة الإطلاق أثناء خطوة النسخ العكسي. س: ما الفرق بين نسخ مزيج Luna® qPCR المعتمدة على المجسات والصبغات؟ ج: يُقاس تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) عادةً بإحدى طريقتين: إما باستخدام صبغة متداخلة تُصدر فلورة أقوى عند ارتباطها بالحمض النووي المزدوج، أو باستخدام أوليغونوكليوتيد "مجس" موسوم بفلورة يرتبط بتسلسل محدد في ناتج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويتم منع الفلورة الخلفية للمجس بوجود مجموعة مثبطة. في حالة مجسات التحلل المائي، يتم فصل المثبط عن الفلوروفور أثناء التضخيم بواسطة نشاط النيوكلياز 5´→3´ لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq. ولتمكين الكشف المعتمد على الصبغات، يحتوي مزيج Luna Universal qPCR على صبغة متداخلة يتم الكشف عنها في قناة SYBR® Green أو FAM لمعظم أجهزة الوقت الحقيقي. لا تحتوي منتجات Luna Universal Probe qPCR على صبغة ربط الحمض النووي المزدوج (لأنها ستتداخل مع استخدام المجسات الموسومة بـ FAM). يجب على المستخدمين إضافة مجس أوليغونوكليوتيد موسوم إلى المزيج، بالإضافة إلى بادئات PCR الأمامية والخلفية. يُرجى ملاحظة أن صبغة المرجع السلبية الموجودة في كلا المزيجين لا تتداخل مع استخدام المجسات الموسومة بـ ROX. س: هل يجب عليّ استخدام الكشف القائم على المجسات أم الكشف القائم على الصبغة في فحوصات qPCR؟ ج: يتطلب الكشف القائم على الصبغة (مثل SYBR® Green) إضافة بادئات PCR فقط، مما يجعله خيارًا اقتصاديًا لـ qPCR. مع ذلك، ستكشف الصبغة المتداخلة عن أي حمض نووي مزدوج السلسلة (dsDNA) ينتج في التفاعل. لذلك، قد يُلاحظ تضخيم خارج الهدف أو تضخيم غير مرتبط بالقالب (NTC) لبعض مجموعات البادئات، مما يؤدي إلى قياس كمي غير دقيق. يمكن استخدام منحنيات التمسخ (الذوبان) التي تُجرى بعد تفاعل PCR للتمييز بين المنتجات الصحيحة وغير النوعية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن قياس سوى مُضخَّم واحد في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) القائم على الصبغة، دون إمكانية إجراء تفاعلات متعددة. يتطلب الكشف القائم على المجسات تصميمَ والحصولَ على مجس أوليغونوكليوتيد مُوسَم بفلوروفور مُحدد التسلسل، بالإضافة إلى بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية. هذا يزيد من تكاليف التحليل، لكن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائمة على المجسات تتميز بدقة عالية للغاية، ومن غير المرجح أن تؤدي إلى قياس كمي غير دقيق بسبب تضخيم NTC. تُصبح التفاعلات المتعددة ممكنة باستخدام المجسات، حيث يمكن تصميم مُضخَّمات مختلفة باستخدام فلوروفورات فريدة وفقًا للإمكانيات البصرية لجهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. س: كيف يُمكنني تصميم البادئات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Luna®؟ ج: نوصي باستخدام برنامج تصميم البادئات (مثل Primer3) لاختيار تسلسلات الهدف والبادئات لزيادة كفاءة التضخيم إلى أقصى حد مع تقليل التضخيم غير المحدد وثنائيات البادئات. يتوافق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي Luna أيضًا مع فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتوفرة تجاريًا. عند تصميم البادئات يدويًا، ننصح بتصميم مُضخّمات قصيرة (من 70 إلى 200 زوج قاعدي) ذات محتوى GC متوازن (40-60%). استهدف درجة حرارة انصهار (Tm) تقارب 60 درجة مئوية باستخدام إعدادات Hot Start Taq في حاسبة Tm من NEB (TmCalculator.neb.com). بالنسبة لأهداف cDNA وRNA، يُنصح بتصميم البادئات عبر مواقع الربط المعروفة (وصلات الإكسون-إكسون) لمنع التضخيم من الحمض النووي الجينومي. س: ما هو طول المُضخّم المناسب لتفاعل qPCR؟ ج: من العوامل المهمة في تجربة qPCR زيادة كفاءة تضخيم PCR، وتساعد المُضخّمات القصيرة على ضمان كفاءة عالية. يتراوح طول مُضخّمات qPCR النموذجية بين 70 و200 زوج قاعدي، ونوصي بتصميم هدفك ضمن هذا النطاق. يمكن استخدام مُضخّمات أطول، ولكن قد يتطلب ذلك تحسينًا (مثل زيادة أوقات التمديد). س: لماذا لون مزيج Luna® qPCR أزرق؟ هل يؤثر هذا الصبغ على عملية الكشف؟ ج: يحتوي مزيج Luna® qPCR على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُعطي المزيج لونًا أزرقًا واضحًا. يُسهّل هذا اللون تحديد الآبار التي تم تحميلها بالكواشف في لوحة qPCR، وهو أمر قد يكون صعبًا نظرًا لصغر حجم الآبار وطبيعة العديد من لوحات qPCR ذات 96 و384 بئرًا غير الشفافة. خضعت الصبغة الزرقاء لتقييمات مكثفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وqPCR، وهي لا تُعيق أو تتداخل مع عملية الكشف في qPCR. س: هل يُمكنني تشغيل مزيج Luna® qPCR على جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: تحتوي مزيجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية عالمية تُتيح التوافق مع مجموعة واسعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم صبغة مرجعية سلبية للتطبيع (مثل Bio-Rad® CFX)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية منخفضة التركيز (مثل Applied Biosystems® 7500 أو QuantStudio®)، أو تلك التي تستخدم صبغة مرجعية سلبية عالية التركيز (مثل Applied Biosystems 7900 أو StepOne®). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001). تفتقر مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مزيج Luna مع ظروف دورات قياسية أو سريعة. س: هل يمكنني استخدام إعدادات الجهاز السريعة مع مزيج Luna® qPCR؟ ج: يتوافق مزيج Luna qPCR مع سرعات التسخين السريعة والقياسية على الأجهزة التي تدعم كلا السرعتين. نوصي بدرجات حرارة وأوقات دورات محددة (راجع البروتوكول أو الدليل لمزيد من المعلومات)، ولكن يمكن استخدام أي من إعدادات التسخين مع ظروف الدورات هذه. (ملاحظة: يجب التحقق من ظروف الدورات بعد تغيير إعداد سرعة التسخين؛ في بعض أجهزة الوقت الحقيقي، سيؤدي تغيير سرعة التسخين أيضًا إلى إعادة ظروف الدورات إلى الإعداد الافتراضي للجهاز). س: هل أحتاج إلى إضافة ROX؟ ج: توصي بعض أجهزة الوقت الحقيقي باستخدام صبغة مرجعية سلبية (عادةً ROX) للتغلب على الاختلافات بين الآبار التي قد تنتج عن قيود الجهاز مثل "تأثير الحافة" والفقاعات والاختلافات الطفيفة في الحجم والتألق الذاتي من الغبار أو الجسيمات في التفاعل. مع ذلك، لا يُسهم توحيد ROX إلا ​​قليلاً في معالجة التباينات الناتجة عن أخطاء سحب القوالب/البادئات، والخلط غير المتجانس، ومشاكل التبخر/التكثيف. تحتوي منتجات Luna® qPCR التالية على صبغة مرجعية سلبية شاملة تُمكّن من التوافق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم توحيدًا مرجعيًا سلبيًا وتلك التي تستخدم كمية منخفضة أو عالية من الصبغة المرجعية السلبية (ROX). مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) ومجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (NEB #M3019) ومزيج LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG (NEB #L4001) ومجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) (NEB #E3007) ومزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029) تفتقر إلى صبغة مرجعية ويمكن استخدامها مع أي جهاز لا يتطلب معايرة ROX. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للجهاز لمزيد من التفاصيل. أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR): Bio-Rad® iQ™5، CFX96، CFX384، Opticon، Roche Lightcycler®، Qiagen Rotor-Gene™، Eppendorf Mastercycler®، Cepheid® SmartCycler®. غير موصى به/مطلوب: Applied Biosystems® 7500، 7500 Fast، QuantStudio™، ViiA7™، Agilent Mx™. تركيز منخفض من ROX (~50 نانومتر نهائي). Applied Biosystems® 5700، 7000، 7300، 7700، 7900، 7900HT، 7900HT Fast، StepOne™، StepOnePlus™. تركيز عالٍ من ROX (~500 نانومتر نهائي). س: كم عدد التخفيفات التي يجب استخدامها لإنشاء منحنى قياسي؟ ج: تتضمن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) النموذجية معايير تغطي خمسة رتب مقدارية (خمسة تخفيفات متسلسلة عشرية) لإنشاء منحنى معياري. اختر أقل كمية معيارية تمثل نسخة واحدة تقريبًا من الهدف عند الرغبة في الحصول على أقصى حساسية. يمكن زيادة أو تقليل عدد النقاط على المنحنى المعياري حسب الرغبة، ويمكن استخدام ثلاث نقاط فقط عندما يكون الهدف والفحص والعينة موصوفة جيدًا. س: لماذا توصي NEB بـ 40-45 دورة؟ ج: تضخيم 40 دورة كافٍ للأهداف ذات النسخ العالية، أو عند استخدام فحص موصوف جيدًا حيث لا يمثل تضخيم غير القالب مصدر قلق. نقترح 45 دورة لزيادة الثقة في الكشف عن الأهداف ذات النسخ المنخفضة إلى نسخة واحدة. قد تساعد الدورات الإضافية أيضًا في الكشف عن التضخيم غير المحدد لمجموعة بادئات معينة عند استخدام مخاليط qPCR القائمة على الصبغة. س: هل يحتوي مزيج Luna® qPCR على dUTP؟ هل يمكنني استخدام طرق منع التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج Luna qPCR باستخدام مزيج من dTTP وdUTP. يضمن هذا تضخيمًا فعالًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالإضافة إلى دمج dU في المنتجات أثناء تفاعل qPCR. تعمل منتجات qPCR التي تحتوي على dU كركيزة لإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز، مما يسمح بمنع التلوث العابر. إذا كان الهدف من التضخيم هو الاستخدام الروتيني، أو إذا كان سيتم فتح أوعية qPCR، أو إذا كان من المرغوب فيه تجنب التلوث العابر، فيمكن إضافة 0.025 وحدة/ميكرولتر من إنزيم Antarctic Thermolabile UDG (NEB #M0372) إلى مزيج التفاعل. عند إضافة إنزيم Antarctic Thermolabile UDG، قم بإعداد تجارب qPCR في درجة حرارة الغرفة أو أضف خطوة حضانة إضافية لمدة دقيقتين عند 25 درجة مئوية قبل ظروف التدوير الافتراضية. س: هل يمكنني إجراء تفاعلات متعددة باستخدام مجموعات Luna® Probe One-Step RT-qPCR؟ هل أحتاج إلى تغيير ظروف التفاعل؟ ج: نعم، لقد تم بنجاح إجراء تفاعلات متعددة لتضخيم ما يصل إلى 5 أهداف باستخدام مجموعات Luna Universal Probe RT-qPCR. اختر الفلوروفورات المختلفة التي تتوافق مع قنوات الكشف المنفصلة لجهاز الوقت الحقيقي. يجب اختبار كل هدف في تفاعل أحادي أولاً. لكل مُضخَّم، ابدأ بإضافة 400 نانومتر من البادئ الأمامي والخلفي و200 نانومتر من المجس في كل تفاعل. إذا لوحظ تدهور في أداء مُضخَّم معين عند استخدامه في فحص متعدد مقارنةً بنتائجه الأحادية، فقد تتطلب التفاعلات تحسينًا. قد يكون من المفيد تقليل تركيزات البادئات للأهداف الوفيرة أو ذات النسخ العالية، و/أو زيادة تركيزات البادئات للأهداف قليلة الوفرة أو ذات النسخ المنخفضة. قد يلزم إجراء المزيد من التحسين مع زيادة التعدد، باستخدام المعايير التالية كإرشادات: البادئ 100-900 نانومتر، المجس 100-500 نانومتر. مثال على تفاعل ثلاثي باستخدام مجموعة Luna Universal One-Step RT-qPCR Probe Kit على جهاز Applied Biosystems™ 7500 Fast: س: هل يمكنني استخدام مسبار موسوم بـ ROX مع مزيج Luna® Probe Mixes الذي يحتوي على صبغة مرجعية عالمية ROX؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب مراعاة متطلبات المعايرة المرجعية السلبية للجهاز في الوقت الحقيقي. بالنسبة للأجهزة التي لا تستخدم معايرة ROX، يمكن عمومًا استخدام مسبار ROX دون قلق أو تعديل الجهاز. أما بالنسبة للأجهزة التي تستخدم ROX للمعايرة، فلا يُنصح عادةً باستخدام مسابير ROX، وهذا الخيار غير متاح في إعدادات الجهاز النموذجية. لا يزال من الممكن استخدام مسابير ROX بشرط إيقاف تشغيل معايرة ROX، ولكن ستُفقد فوائد المعايرة. لمن يفضلون مزيجًا خاليًا من ROX، يُرجى الاطلاع على مجموعة Luna Probe One-Step RT-qPCR (بدون ROX) (NEB# E3007) أو مزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X مع UDG (بدون ROX) (NEB #M3029)، أو التواصل عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. س: هل يمكن استخدام استراتيجيات كشف بديلة تعتمد على المجسات مع مزيج Luna® Probe؟ ج: نعم. لقد تم اختبار كل من Molecular beacon وScorpions® بنجاح مع مزيج مجسات Luna. كما يُمكن استخدام تصميمات مجسات أخرى شريطة أن تكون متوافقة مع نشاط إنزيم Hot Start Taq DNA Polymerase من نوع 5´→3´. س: ما هي كمية البادئ والمجس التي يجب استخدامها مع مجموعة Luna® Universal Probe RT-qPCR؟ ج: بالنسبة لمعظم الأهداف، يوفر التركيز النهائي 400 نانومتر لكل بادئ و200 نانومتر للمجس الأداء الأمثل. إذا لزم الأمر، يمكن ضبط تركيز البادئ النهائي بين 100 و900 نانومتر، وتركيز المجس النهائي بين 100 و500 نانومتر. س: كيف أختار بين تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة وتقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة؟ ج: تتوفر طريقتان لتحديد كمية عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA): تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة وتقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة. في كلتا الحالتين، يُنسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) عكسيًا إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA)، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم الحمض النووي الريبوزي الكمي (qPCR). يمكن إجراء النسخ العكسي بشكل منفصل عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (أي تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة) أو مباشرةً في مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (أي تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة). تُفضل عادةً إجراءات العمل أحادية الخطوة في فحوص التشخيص الجزيئي. أما تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة فتُفضل عند إجراء تحليلات متعددة على نفس المادة الأولية أو عند الحاجة إلى أرشفة الحمض النووي التكميلي (cDNA). للحصول على مزيد من التفاصيل، يُرجى الرجوع إلى "اختيار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي أحادي الخطوة أو ثنائي الخطوة". س: ما هي عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يمكن استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي باستخدام مزيج Luna®؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخلاص أو تنقية مادة الحمض النووي الريبوزي الأولية. تعمل مجموعة Luna RT-qPCR مع الأحماض النووية من أنواع مختلفة من العينات التي تم تنقيتها باستخدام الطرق التقليدية القائمة على الأعمدة (مثل مجموعة Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010)). عند إجراء الدراسات باستخدام مزارع الخلايا الثديية، يمكن إضافة مستخلصات الخلايا الناتجة عن وحدة Luna Cell Ready Lysis Module (NEB #E3032) إلى جميع كواشف Luna أحادية الخطوة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت العديد من الدراسات بشكل مباشر توافق كواشف Luna مع اللعاب وعينات أخرى ذات صلة سريرية باستخدام بروتوكولات تحضير العينات الأولية. SalivaDirect مثال على ذلك. س: ما كمية قالب الحمض النووي الريبوزي التي يجب استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي؟ ج: تعمل مجموعة Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit بكفاءة مع قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقى، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الكلي، والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، وعينات النسخ المختبرية. الكمية في تفاعل 20 ميكرولتر: الحمض النووي الريبوزي الكلي ≤ 1 ميكروغرام، الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين ≤ 0.1 ميكروغرام، النسخ المختبرية ≤ 10⁹ نسخة. س: هل يمكنني استخدام أهداف أطول في تفاعل RT-qPCR أحادي الخطوة؟ ج: بشكل عام، تميل المضخمات الأصغر (70-200 زوج قاعدي) إلى تحقيق كفاءة أعلى وقيم عتبة (Cq) مبكرة. بالنسبة للأهداف في هذا النطاق الحجمي، يُوصى بوقت تمديد 30 ثانية. ستستفيد الأهداف الأطول من أوقات تمديد أطول، لكن الوقت الفعلي سيعتمد على طول الهدف ونوع الجهاز، ويجب تحديده تجريبيًا. س: ما هي درجة الحرارة التي يجب استخدامها لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعات Luna® RT-qPCR؟ ج: يدعم إنزيم النسخ العكسي Luna WarmStart® المقاوم للحرارة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بكفاءة عالية عند درجات حرارة مرتفعة مقارنةً بإنزيم MMLV. بشكل عام، يمكن إتمام تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بحضانة لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. بالنسبة للقوالب الصعبة، يمكن رفع درجة حرارة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) إلى 60 درجة مئوية. س: هل يجب عليّ تضمين عينة تحكم خالية من إنزيم Luna® WarmStart® (عينة تحكم -RT)؟ ج: نعم. يشير التضخيم في غياب إنزيم النسخ العكسي في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) عادةً إلى وجود حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) ملوث في عينة الحمض النووي الريبوزي (RNA) المدخلة. معالجة عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام إنزيم DNase ستزيل أي حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). س: هل مجموعة Monarch® Total RNA Miniprep Kit متوافقة مع كواشف Luna® RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقى باستخدام هذه المجموعات في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. يُنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) للحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بواسطة نظام Monarch من أنواع عينات مختلفة نتائج عالية الجودة باستمرار، مما يسمح بالقياس الكمي الدقيق والقابل للتكرار. ولإثبات جودة وفائدة الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من نظام Monarch للقياس الكمي باستخدام تقنية RT-qPCR، أُجريت 16 تجربة وتم تصويرها باستخدام منهجية "النقاط داخل المربعات" التي طُوّرت في شركة NEB. تشمل كل تجربة ثلاث تفاعلات متكررة لنطاق لوغاريتمي من تركيزات القالب المُدخل، بالإضافة إلى عينات تحكم سلبية (NTC) (18 تفاعلًا إجمالًا). تُعرَّف تجربة RT-qPCR عالية الجودة، والمُمثلة بنقطة داخل المربع، بأنها ذات كفاءة تتراوح بين 90-110%، وقيمة ΔCq ≥ 3 (حيث ΔCq هو الفرق بين متوسط ​​قيمة Cq لعينة التحكم السلبية وأقل تركيز مُدخل)، ودرجة جودة ≥ 4 (بناءً على الخطية، وقابلية التكرار، وشكل المنحنى، ومعايير أخرى). استُخدمت بادئات تستهدف متغيرات GAPDH (في الجرذان والفئران والطماطم والخميرة)، ومتغيرات PGK (في الجرذان)، ومتغيرات β-actin (في الجرذان والفئران والطماطم) مع الحمض النووي الريبوزي الكلي المُستخلص من دماغ الجرذان وكبدها وكليتها، وكلية الفئران، وأوراق الطماطم، والخميرة كقوالب. جُمعت فحوصات RT-qPCR وفقًا للتعليمات باستخدام كواشف Luna RT-qPCR، وأُجريت دوراتها على جهاز Bio-Rad CFX384. يُنتج تفاعل RT-qPCR على الحمض النووي الريبوزي المُستخلص بواسطة Monarch منحنيات qPCR عالية الجودة تُظهر قياسًا كميًا دقيقًا عبر مجموعة واسعة من أنواع العينات. خُفف الحمض النووي الريبوزي المُستخلص بواسطة Monarch من دم الإنسان الكامل، وكلية الجرذان، وأوراق الطماطم، وخميرة S. cerevisiae لإنتاج نطاق لوغاريتمي من خمسة تراكيز قالب الإدخال. استُخدمت بادئات تستهدف متغيرات GAPDH (الطماطم، الخميرة)، أو PGK (الفئران)، أو SMG1 (دم الإنسان) في فحوصات RT-qPCR، وجُمعت وفقًا للتعليمات باستخدام كواشف Luna RT-qPCR (NEB #E3005)، وخضعت لدورات على جهاز Bio-Rad CFX384. س: هل مجموعات Monarch Spin لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) متوافقة مع كواشف Luna RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى بهذه المجموعات في RT-qPCR مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. س: هل يمكنني استخدام أوقات دورات أقصر؟ ج: نعم. بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن استخدام أوقات حضانة أقصر في كل خطوة. ومع ذلك، يُوصى بظروف الدورات القياسية كنقطة بداية، وقد تكون مطلوبة للفحوصات الصعبة مثل تلك التي تحتوي على كمية قليلة من الحمض النووي (DNA). س: ما هي الاختلافات بين منتجات Luna One-Step RT-qPCR (NEB #E3006، #E3007، #M3019، #M3029، و#L4001)؟ ج: جميع منتجات Luna هذه مُحسَّنة لإجراء تفاعل RT-qPCR بخطوة واحدة باستخدام الكشف عن المجسات. NEB #M3019/#M0329 عبارة عن مزيج رئيسي 4X في أنبوب واحد. يحتوي منتجا NEB #E3006/#E3007 على أنابيب منفصلة لمزيج التفاعل 2X ومزيج الإنزيم 20X. كما يحتوي المنتج M3019 على dUTP بالإضافة إلى UDG حساس للحرارة، لضمان منع التلوث المتبقي. NEB #L4001 هو نسخة مجففة بالتجميد من NEB#M3019، وهو متوفر في قوارير أو صفائح 96 بئراً. يفتقر كل من NEB #E3007 و#M3029 إلى صبغة مرجعية سلبية ROX عالمية. تختلف الخلطات المتاحة من حيث الشكل ودرجة حرارة التخزين وإضافة إنزيم UDG الحساس للحرارة لمنع التلوث المتبقي، كما هو موضح في الجدول أدناه. NEB #M3019 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG NEB #M3029 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) NEB #E3006 Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB #E3007 Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX) NEB #L4001 LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix with UDG Format 4X Master Mix 4X Master Mix 2X Reaction Mix 20X Enzyme Mix 2X Reaction Mix 20X Enzyme Mix Lyophilized Master Mix; إعادة الترطيب بمعدل 2-4 أضعاف. منع التلوث المتبقي متضمن. نعم (يشمل dUTP وUDG غير المستقر حراريًا). نعم (يشمل dUTP وUDG غير المستقر حراريًا). لا (يشمل dUTP؛ يتطلب إضافة UDG). لا (يشمل dUTP؛ يتطلب إضافة UDG). نعم (يشمل dUTP وUDG غير المستقر حراريًا). صبغة التطبيع (ROX عالمي). نعم، نعم، نعم، نعم. تعدد الإرسال: نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). نعم (حتى 5 إرسالات). الحد الأقصى لحجم العينة (20 ميكرولتر من تفاعل RT-qPCR): حتى 10 ميكرولتر. حتى 10 ميكرولتر. حتى 8 ميكرولتر. حتى 8 ميكرولتر. حتى 10 ميكرولتر. ظروف التدوير القياسية: 25 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (معالجة UDG)؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية، و٢٥ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية (معالجة UDG)؛ ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة من ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. ٢٥ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية (معالجة UDG)؛ ٥٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق؛ ٩٥ درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ ٤٥ دورة عند ٩٥ درجة مئوية لمدة ١٠ ثوانٍ، و٦٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ ثانية. درجة حرارة التخزين: -٢٠ درجة مئوية. درجة حرارة الغرفة (من ١٥ إلى ٢٥ درجة مئوية). س: هل يمكنني استخدام مزيج Luna Probe RT-qPCR للكشف عن الفيروسات؟ ج: نعم، مزيج Luna Probe RT-qPCR مناسب جدًا للكشف الحساس عن الفيروسات المستهدفة، بما في ذلك فيروس SARS-CoV-2. يمكنكم الاطلاع على أمثلة لكيفية استخدام Luna ومنتجات أخرى على صفحة أبحاث COVID-19 الخاصة بنا.