نيو إنجلاند بيولابس، E3010L، مجموعة لونا سكريبت® آر تي سوبر ميكس

مجموعة LunaScript RT SuperMix ( الفئات ذات الصلة: تطبيقات Luna® qPCR وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي ثنائي الخطوة، النسخ العكسي (تخليق الحمض النووي المكمل)، الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني استخدام عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقاة من ظروف تخزين مختلفة مثل RNALater في تفاعلات تخليق الحمض النووي المكمل LunaScript®؟ ج: بشكل عام، تعمل عينات الحمض النووي الريبوزي المنقى من مصادر مختلفة بشكل جيد مع منتجات LunaScript. نوصي عادةً بتنقية الحمض النووي الريبوزي باستخدام الطرق القائمة على الأعمدة (مثل مجموعة Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010S)). س: هل يمكنني إضافة بادئات خاصة بجين معين في تفاعل تخليق الحمض النووي المكمل LunaScript®؟ ج: تم تحسين LunaScript RT SuperMix للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي ثنائي الخطوة، ويحتوي على كل ما يلزم لتخليق الحمض النووي المكمل بما في ذلك بادئ dT وسداسي النيوكليوتيدات العشوائي. إذا كنت ترغب في استخدام بادئات بديلة أو خاصة بجين معين لتخليق الحمض النووي المكمل، فإن LunaScript RT Master مجموعة المزج (بدون بادئات) هي الأنسب. مزيج LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات) (NEB #3025) مطابق لمزيج LunaScript RT SuperMix ولكن بدون بادئات. س: هل يمكنني تحضير تفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) في درجة حرارة الغرفة عند استخدام LunaScript® RT SuperMix؟ ج: نعم. يمكن تحضير تفاعلات تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من LunaScript في درجة حرارة الغرفة. س: هل يمكنني استخدام وقت حضانة أقصر لتفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) عند استخدام LunaScript® RT SuperMix؟ ج: نعم. بالنسبة للعديد من الأهداف، يمكن استخدام أوقات حضانة تصل إلى دقيقتين لخطوة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) عند 55 درجة مئوية. ومع ذلك، يوصى بظروف التدوير القياسية كنقطة بداية، وقد تكون مطلوبة للاختبارات الصعبة، و/أو مع عينات الحمض النووي الريبي (RNA) التي تحتوي على شوائب. س: هل يمكنني استخدام منتجات LunaScript® cDNA مباشرة في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)؟ ما هي الكمية التي يمكنني استخدامها للكشف في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)؟ ج: يمكن استخدام منتج الحمض النووي المكمل (cDNA) مباشرة في تفاعل qPCR. بشكل عام، نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من منتج cDNA في تفاعل qPCR بحجم 20 ميكرولتر. عند الحاجة، يمكن استخدام ما يصل إلى 20% من حجم تفاعل qPCR كمنتج cDNA غير مخفف (مثلاً، 4 ميكرولتر من منتج cDNA في تفاعل qPCR بحجم 20 ميكرولتر). س: ما كمية قالب RNA التي يجب استخدامها في تفاعلات تخليق cDNA باستخدام LunaScript®؟ ج: تعمل خلطات LunaScript بشكل جيد مع قوالب RNA النقية، بما في ذلك RNA الكلي، وmRNA، وعينات النسخ المختبرية. الكمية في تفاعل بحجم 20 ميكرولتر: RNA الكلي ≤ 1 ميكروغرام، Poly(A)-RNA ≤ 1 ميكروغرام، النسخ المختبرية 100 نانوغرام. س: كيف يجب تخزين منتجات cDNA باستخدام LunaScript®؟ ج: يمكن تخزين منتج cDNA عند 4 درجات مئوية للاستخدام قصير المدى. للتخزين طويل المدى، يجب تخزينه عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. س: كيف أختار بين تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة أو ثنائية الخطوة؟ ج: تتوفر طريقتان لتحديد كمية عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA): تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة وتقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة. في كلتا الحالتين، يُنسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) عكسيًا إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA)، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم qPCR. يمكن إجراء النسخ العكسي بشكل منفصل عن qPCR (أي، تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة) أو مباشرةً في مزيج qPCR (أي، تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة). تُفضل عادةً إجراءات العمل أحادية الخطوة في فحوص التشخيص الجزيئي، حيث قد تكون كمية العينات محدودة أو عند فحص عينات عديدة. تُفضل تقنية RT-qPCR ثنائية الخطوة عند إجراء فحوصات متعددة على نفس المادة الأولية أو عند الحاجة إلى أرشفة الحمض النووي التكميلي (cDNA). لمزيد من التفاصيل، يُرجى الرجوع إلى "اختيار تقنية RT-qPCR أحادية الخطوة أو ثنائية الخطوة". س: هل يجب تضمين عينة تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (RT)؟ س: ما هو رد الفعل عند إعداد تفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: نعم. عند وجود الحمض النووي الجينومي أو نواتج النقل، قد تتداخل مع التحديد الكمي الدقيق للحمض النووي الريبوزي (RNA)، خاصةً للأهداف ذات النسخ المنخفضة. لذلك، من المهم إجراء تفاعلات التحكم المناسبة (بدون إنزيم النسخ العكسي) لمراعاة هذه التأثيرات. بالإضافة إلى ذلك، يجب إعداد تفاعلات التحكم بدون قالب (NTC) لإثبات أن التفاعلات الإيجابية ذات دلالة. يُرجى الرجوع إلى مجموعة LunaScript RT SuperMix Kit (NEB #E3010) إذا كنت بحاجة إلى مزيج تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي. س: ما هي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التي توصون بها للكشف عن منتجات الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: تم تقييم منتجات الحمض النووي المكمل (cDNA) المُنتجة باستخدام مزيج LunaScript® على نطاق واسع في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام مزيج Luna® Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004). يوفر هذان المنتجان معًا سير عمل RT-qPCR من خطوتين بحساسية ممتازة وتحديد كمي خطي دقيق. بالإضافة إلى ذلك، يتوافق LunaScript مع كواشف أخرى. مزيجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التجارية الرئيسية. س: ما هي درجة الحرارة المناسبة لتفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) باستخدام LunaScript®؟ ج: يدعم إنزيم النسخ العكسي Luna® المقاوم للحرارة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بكفاءة عالية عند درجات حرارة مرتفعة مقارنةً بإنزيم النسخ العكسي MMLV RT. بالنسبة لمعظم الأهداف، يمكن إتمام تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بحضانة لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. أما بالنسبة للقوالب الصعبة، فيمكن رفع درجة حرارة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) إلى 65 درجة مئوية. س: لماذا أحصل على كميات قليلة من الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: هناك عدة أسباب لانخفاض كمية الحمض النووي المكمل (cDNA). إليك بعض الاقتراحات لتحسين الكمية: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز المُشوه أو باستخدام جهاز BioAnalyzer (Agilent). يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) كامل الطول. يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي (RNA) نسبة امتصاص ضوئي لا تقل عن 1.7 عند 260 نانومتر إلى امتصاص ضوئي لا تقل عن 280 نانومتر، أو رقم RIN أكبر من 8. يمكن إزالة الحمض النووي الريبوزي غير المرغوب فيه عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسله بالإيثانول بنسبة 70%. الملوثات مثل EDTA والجوانيدينيوم. يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم. يمكن إزالة البروتينات الملوثة مثل البروتيازات من خلال خطوة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي أو استخلاص الفينول/الكلوروفورم. يُنصح بزيادة كمية الحمض النووي الريبوزي المستخدم، خاصةً للحمض النووي الريبوزي منخفض الوفرة. س: هل يؤثر الصبغ الأزرق في LunaScript® RT SuperMix على عملية الكشف؟ ج: تحتوي منتجات LunaScript على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُعطي المزيج لونًا أزرقًا واضحًا. يُسهّل هذا اللون تتبع إعداد التفاعل من خلال تحديد وجود أو عدم وجود تفاعلات الحمض النووي التكميلي (cDNA) واختلافات حجمها داخل الأنابيب، وأطراف الماصات، وتفاعلات qPCR اللاحقة. تم تقييم الصبغ الأزرق على نطاق واسع في تجارب تخليق الحمض النووي التكميلي وqPCR، ولم يُلاحظ أنه يُثبّط أو يتداخل مع الكشف عن الحمض النووي الريبوزي. س: كيف أختار بين مجموعات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من NEB؟ ج: يُبرز الجدول 1 المزايا والتطبيقات الرئيسية لمجموعات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA). من شركة NEB. مجموعات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA): مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010)، مجموعة LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (NEB #E3025)، مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560). المكونات: LunaScript RT SuperMix (5X)*، مزيج التحكم بدون RT (5X)*، ماء خالٍ من النيوكلياز. *يحتوي كلا المزيجين على سداسي النيوكليوتيدات وd(T)10. LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (5X)، مزيج التحكم بدون RT (خالية من البادئات) (5X)، ماء خالٍ من النيوكلياز. ProtoScript II Enzyme Mix (10X)، ProtoScript II Reaction Mix (2X)، Oligo d(T)23VN (50 ميكرومولار)، مزيج البادئات العشوائية (60 ميكرومولار)، ماء خالٍ من النيوكلياز. التنسيق، التطبيق الموصى به، البادئات، فترة الحضانة لخطوتين. الكشف بتقنية RT-qPCR باستخدام سداسي البادئات وd(T)10: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. للكشف بتقنية RT-qPCR على مرحلتين: مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام: d(T)23VN أو بادئات خاصة بالجين: 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام: d(T)23VN أو بادئات خاصة بالجين: 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة؛ 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة؛ 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. المزايا: ✓ مزيج فائق ✓ قصير بروتوكول ✓ مؤشر تتبع مرئي ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ حجم أكبر من مدخلات الحمض النووي الريبي ✓ اختيار مرن للبادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ مؤشر تتبع مرئي ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ حجم أكبر من مدخلات الحمض النووي الريبي ✓ اختيار مرن للبادئات ✓ كل شيء متضمن. اتبع شجرة القرار أدناه لاختيار مجموعة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) للسلسلة الأولى بناءً على تطبيقاتك اللاحقة. الشكل 1. يدعم مزيج LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات) العديد من التطبيقات. من خلال إضافة بادئات مختلفة، بما في ذلك مزيج البادئات العشوائي، وd(T)23VN، والسداسيات العشوائية، يمكن أن يكون الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتج بواسطة مزيج LunaScript RT Master Mix مناسبًا تمامًا للتطبيقات اللاحقة مثل الكشف بتقنية RT-qPCR، وRT-PCR، ودراسات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq). س: عند استخدام منتجات LunaScript cDNA في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) اللاحق (أي، تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي على مرحلتين)، ما هي الأحجام ومنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يمكن استخدامها؟ ج: منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) من تتوافق تفاعلات LunaScript مع العديد من كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). نوصي عادةً باستخدام OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 أو NEB #M0485) للكشف عن تفاعل PCR حتى 5 كيلوبايت، وQ5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) للحصول على أعلى دقة، وLongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) للحصول على كميات كبيرة من المنتجات الأطول. قد يختلف حجم cDNA الأمثل المُدخل، ويجب تحسينه، اعتمادًا على الأهداف/البادئات، ولكننا نوصي عادةً باستخدام 1 ميكرولتر من تفاعل cDNA كمدخل في تفاعل PCR بحجم 25 ميكرولتر. عند الحاجة، يمكن إضافة ما يصل إلى 20% من حجم تفاعل PCR (مثل 5 ميكرولتر من منتج cDNA في تفاعل PCR بحجم 25 ميكرولتر). سؤال: هل يمكنني استخدام LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)؟ جواب: يحتوي LunaScript RT SuperMix على كلٍ من... توفر هذه التقنية تغطية متساوية لقوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام سداسيات النيوكليوتيدات وقليلات النيوكليوتيدات dT. وقد استُخدمت في تسلسل جينوم فيروس SARS-CoV-2 باتباع بروتوكولات متنوعة، بما في ذلك بروتوكولات شبكة ARTIC. تتوفر حلول مُجهزة بالكامل ضمن منتجات NEB التالية: NEB #E7660، NEB# E7658، NEB #E7560. س: كيف أختار بين مجموعة LunaScript® RT SuperMix ومجموعة ProtoScript لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى؟ ج: تحتوي مجموعات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى على أنواع مختلفة من إنزيمات النسخ العكسي، وتكمن الاختلافات الرئيسية في تطبيقاتها الأساسية، وشكلها، ودرجة حرارة التفاعل. فيما يلي ملخص لمجموعاتنا الثلاث لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى: المنتج: LunaScript RT SuperMix Kit (E3010)، ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit (E6560)، ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit (E6300)، RT Luna reverse transcriptase ProtoScript إنزيم النسخ العكسي M-MuLV صيغة Supermix مزيج التفاعل، مزيج الإنزيم، البادئ التطبيق الأساسي: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي ثنائي الخطوات (RT-qPCR) نقطة النهاية: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي حتى 10 كيلوبايت نقطة النهاية: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي حتى 5 كيلوبايت التطبيق الثانوي: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي حتى 3 كيلوبايت درجة حرارة التفاعل: حتى 65 درجة مئوية (55 درجة مئوية هي الدرجة المثلى) حتى 48 درجة مئوية (42 درجة مئوية هي الدرجة المثلى) حتى 45 درجة مئوية (42 درجة مئوية هي الدرجة المثلى) كمية الحمض النووي الريبي المدخلة: من 1 ميكروغرام إلى 1 بيكوغرام مدة الحضانة: دقيقتان عند 25 درجة مئوية، 10 دقائق عند 55 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 95 درجة مئوية، 5 دقائق عند 25 درجة مئوية، 60 دقيقة عند 42 درجة مئوية، 5 دقائق عند 85 درجة مئوية، 5 دقائق عند 25 درجة مئوية دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ميزات إضافية: صبغة تتبع زرقاء، بروتوكول سريع لمدة 13 دقيقة. س: هل يمكنني استخدام وقت حضانة أقصر لتفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) عند استخدام مزيج LunaScript® RT Master Mix (خالٍ من البادئات)؟ هل تزيد فترة الحضانة الأطول من كمية الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: في ظل الظروف الموصى بها (55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق)، يمكن لمزيج LunaScript RT Master Mix (خالٍ من البادئات) إنتاج حمض نووي مكمل (cDNA) يصل طوله إلى 9 كيلوبايت. بالنسبة لبعض الأهداف/سير العمل، يمكن الكشف عن المنتجات بعد 5 دقائق. في بعض الحالات، قد تؤدي فترة حضانة أطول (تصل إلى 60 دقيقة) إلى زيادة كمية الحمض النووي المكمل (cDNA). يمكن إجراء تجارب أولية لتحديد وقت الحضانة الأمثل. س: كيف أختار بين إنزيم النسخ العكسي Induro ومنتجات LunaScript وProtoScript المختلفة؟ ج: إنزيم النسخ العكسي Induro هو إنزيم نسخ عكسي مشفر بواسطة إنترون من المجموعة الثانية، وهو مفيد لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من النسخ الطويلة. تُستخدم هذه الكواشف مع الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبوزي التي تحتوي على مثبطات. في المقابل، تُعد كواشف LunaScript مزيجًا رئيسيًا. يُناسب مُنتج LunaScript RT Master Mix Kit (خالٍ من البادئات) (NEB #E3025) تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل عام. أما منتجات LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) فهي مُحسّنة لسير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات، حيث لا تتطلب سوى منتجات cDNA قصيرة. كما يُستخدم LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل ARTIC SARS-CoV-2. يُوضح هذا الجدول تطبيقات وميزات كل منها. منتجات النسخ العكسي للفيروسات القهقرية المشفرة بالإنترونات، إنزيم النسخ العكسي Induro™ (NEB #M0681)، مُنتج LunaScript® RT SuperMix Kit (NEB #E3010)، مُنتج LunaScript RT SuperMix (NEB #M3010)، مُنتج LunaScript RT Master Mix Kit (NEB #E3025). مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560) التطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي الطويل، عينات الحمض النووي الريبوزي غير النقي، تطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (مثل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبوزي، وتسلسل الحمض النووي التكميلي طويل القراءة، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الناقل)، تطبيقات الكشف بتقنية RT-qPCR على مرحلتين، تطبيقات الكشف بتقنية RT-qPCR على مرحلتين، تخليق الحمض النووي التكميلي العام، تطبيقات الكشف بتقنية RT-PCR على مرحلتين، تخليق الحمض النووي التكميلي العام، تطبيقات الكشف بتقنية RT-qPCR على مرحلتين، ✓ بروتوكول قصير ✓ خيارات مرنة للبادئات، dNTPs معدلة ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة للبادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة للبادئات ✓ تنسيق مجموعة يشمل جميع المكونات الضرورية. س: كيف أعرف ما إذا كان قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بي ذا جودة جيدة؟ ج: يُعدّ الحمض النووي الريبوزي السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. عادةً ما تشير نسبة الامتصاص عند A260/A280 التي تزيد عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8 على جهاز BioAnalyzer إلى جودة عالية للحمض النووي الريبوزي.