مجموعة اختبار Luna® SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex من شركة New England Biolabs، رقم المنتج E3019S

تم إيقاف إنتاج الحجم الكبير من هذا المنتج (NEB #E3019L) في 15 ديسمبر 2024. وسيظل الحجم الصغير متوفرًا. الفئات ذات الصلة : Luna® qPCR وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتقنيات التضخيم. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وRT-qPCR القائم على المجسات، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (RT-qPCR) ثنائي الخطوات. الأسئلة الشائعة : س: هل تؤثر متغيرات فيروس SARS-CoV-2 المختلفة على فعالية مجموعة اختبار Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR المتعددة؟ ج: تحديث من Omicron: اختبار Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR (NEB #E3019) هو اختبار متعدد للاستخدام البحثي فقط (RUO) يعتمد على جينات N1 وN2 لفيروس SARS-CoV-2 المصممة من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها الأمريكية (CDC). يحتوي متحور كوفيد-19 الجديد، أوميكرون، على طفرة نقطية واحدة في منطقة من جين N تستهدفها مسبار N1 (C28311U). وقد أسفر الاختبار المباشر للحمض النووي الريبي النقي الذي يمثل كلاً من قالب N1 للنوع البري (ووهان) والطفرة (أوميكرون) من فيروس سارس-كوف-2 عن نتائج متطابقة إلى حد كبير، مع الكشف عن كلتا العينتين بنسبة 100% عند 10 نسخ لكل تفاعل (تم اختبار 27/27 تكرارًا). بالإضافة إلى ذلك، تحتوي مجموعة فرعية من متحور أوميكرون BA.5 على طفرة نقطية إضافية في الطرف 3′ لمسبار N1 (A28330G). كما أسفر اختبار الحمض النووي الريبي النقي الذي يمثل كلاً من قالب النوع البري (ووهان) والطفرة BA.5 (C28311U، A28330G) عن نتائج متطابقة إلى حد كبير. وقد طورت شركة NEB أداة ويب (Primer Monitor) لمراقبة مجموعات البادئات المسجلة باستمرار بحثًا عن متحورات متداخلة في التسلسلات من قاعدة بيانات GISAID. باستخدام هذه الأداة، حددنا متغيرًا بارزًا من بعض البلدان يحمل طفرة نيوكليوتيدية مفردة (SNP) قريبة من النهاية 3' للبادئ الأمامي 2019-nCoV-2_N2 المُضمّن في مجموعة Luna، والذي يكشف عن أهداف CDC SARS-CoV-2 N1 وN2 وجين RNase P البشري المُعدّل (انقر للمزيد من التفاصيل) (أ). لتقييم تأثير هذه الطفرة النيوكليوتيدية المفردة على كشف هدف N2، حضّرنا قطعتين من الحمض النووي الريبوزي (RNA) لجين N تحتويان على هدف N2 من النوع البري والطافر، على التوالي، عن طريق النسخ المختبري، وقمنا بقياسهما كميًا باستخدام SARS-CoV-2 RNA Control 2 من Twist Bioscience. باستخدام مجموعة البادئ/المسبار المُضمّنة في مجموعة Luna، لاحظنا تأخيرًا متوسطًا قدره 4.2 Cq لهدف N2 الطافر (ب). كان حد الكشف (LOD) لهدف N2 الطافر 25 نسخة/تفاعل. على الرغم من أن جميع التفاعلات التي تحتوي على 10 نسخ من الحمض النووي الريبي المتحور قد ولّدت إشارة تضخيم، إلا أن 11 تفاعلًا فقط من أصل 24 كان لها قيمة Cq ≤ 40، وهي الحد الأدنى للكشف (C). س: ما هي المكونات المضمنة في مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit؟ ج: تحتوي مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit على جميع المكونات اللازمة لإجراء فحوصات RT-qPCR المتعددة كما هو موضح بالتفصيل أدناه. يتم توفير مزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Master Mix مع UDG (NEB #M3019) بتركيز 4X ويحتوي على جميع المكونات اللازمة لـ One-Step RT-qPCR. كما أنه مُصمم بصبغة مرجعية سلبية فريدة متوافقة مع مجموعة متنوعة من منصات الأجهزة، وdUTP/UDG لمنع التلوث المتبقي، وصبغة مرئية غير فلورية لمراقبة إعداد التفاعل. يحتوي مزيج البادئات/المجسات الخاص بفيروس SARS-CoV-2، والمُرفق بهذه المجموعة، على بادئات ومجسات مُخصصة لمنطقتين من جين N الخاص بفيروس SARS-CoV-2 [استنادًا إلى التسلسلات المُقدمة من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC)]. مع ذلك، فقد تم تعديلها لتضمين فلوروفورات مختلفة (N1، HEX؛ N2، FAM) لتمكين المراقبة المتزامنة على قناتين مختلفتين لجهاز التحليل في الوقت الحقيقي. ولضمان سلامة المادة المُدخلة وعدم وجود تثبيط، تم توفير مجموعة بادئات ومجسات للتحكم الداخلي (IC)، مُصممة لتضخيم جين RNaseP البشري، ضمن مزيج البادئات. تم تعديل البادئ العكسي لهذا الهدف عن تصميم CDC لاستهداف حدود الإكسون/الإكسون لتقليل التضخيم الخلفي الناتج عن الحمض النووي الجينومي المُلوث المُحتمل. تتم مُلاحظة تضخيم IC في قناة Cy5. كما تم توفير قالب تحكم إيجابي (PC) (جين N الخاص بفيروس SARS-CoV-2 مُستنسخ في بلازميد). س: كم عدد عينات الاختبار التي يمكن تحليلها على صفيحة ذات 96 بئرًا؟ ج: تتيح مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit الكشف المتزامن عن منطقتين من جين N لفيروس SARS-CoV-2 بالإضافة إلى عنصر تحكم داخلي. نوصي بإجراء اختبار تحكم إيجابي واحد واختبار تحكم سلبي واحد لكل صفيحة، مما يسمح بتحليل ما يصل إلى 94 عينة اختبار على صفيحة ذات 96 بئرًا. س: هل تُمكّن مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit من منع انتقال العينات/تقليل التلوث؟ ج: نعم، تحتوي المجموعة على مزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Master Mix مع UDG (NEB #M3019)، وهو مُصاغ بمزيج من dTTP وdUTP. يُمكّن هذا من دمج dU في نواتج التفاعل دون التأثير على كفاءة التضخيم. إنزيم جليكوزيلاز الحمض النووي اليوراسيل غير المستقر حراريًا في القطب الجنوبي (UDG) الموجود في المزيج يهضم نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) التي تحتوي على dU، مما يمنع التلوث الناتج عن نواتج التضخيم المتبقية. نظرًا لأن تفاعل RT-qPCR يمكن أن يُنتج كميات كبيرة من الحمض النووي، فإن أفضل الممارسات تشمل استخدام استراتيجيات متنوعة للحد من التلوث، مثل استخدام ضوابط بيئية وعدم فتح الأوعية بعد التضخيم. س: هل يمكنني إعداد اختبار SARS-CoV-2 في درجة حرارة الغرفة؟ ج: يحتوي مزيج Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X مع UDG (NEB #M3019) المُرفق في المجموعة على Luna WarmStart® RT مقترنًا بـ Hot Start Taq، مما يُتيح الإعداد في درجة حرارة الغرفة. للحصول على أفضل النتائج، يجب حفظ الكواشف من المجموعة على الثلج أثناء إعداد التفاعل وتخزينها عند -20 درجة مئوية. س: ما مقدار العينة التي يمكن إضافتها إلى التفاعل كمدخل لاختبار SARS-CoV-2؟ ج: بالنسبة لاختبارات 96 بئرًا، نوصي عادةً باستخدام 2-10 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر للحصول على أفضل النتائج. أما بالنسبة لاختبارات 384 بئرًا اليدوية، فنوصي باستخدام ما يصل إلى 5 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص في تفاعل حجمه 10 ميكرولتر. في بعض إجراءات العمل باستخدام 384 بئرًا، يمكن أيضًا استخدام تفاعلات حجمها 5 ميكرولتر (بحد أقصى 2 ميكرولتر من عينة الإدخال). س: ما هي الأهداف التي يكشف عنها مزيج البادئات/المجسات لفيروس SARS-CoV-2؟ وكيف تم اختيار هذه البادئات؟ ج: يحتوي مزيج البادئات/المجسات لفيروس SARS-CoV-2 المرفق بهذه المجموعة على بادئات ومجسات خاصة بمنطقتين من جين N لفيروس SARS-CoV-2 (استنادًا إلى التسلسلات المقدمة من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها). مع ذلك، تم تعديلها لتضمين فلوروفورات مختلفة (N1، HEX؛ N2، FAM) لتمكين المراقبة المتزامنة على قناتين مختلفتين لجهاز الوقت الحقيقي. ولضمان سلامة المادة المدخلة وعدم وجود تثبيط، تم توفير مجموعة محسّنة من البادئات والمجسات للتحكم الداخلي (IC)، مصممة لتضخيم جين RNaseP البشري، ضمن مزيج البادئات. ويُلاحظ تضخيم التحكم الداخلي في قناة Cy5. س: هل تسلسل مجموعة بادئات/مجسات RNase P هو نفسه تسلسل CDC؟ ج: تم تعديل البادئ العكسي لهذا الهدف عن تصميم CDC لاستهداف حدود الإكسون/الإكسون لتقليل التضخيم الخلفي الناتج عن الحمض النووي الجينومي الملوث المحتمل. س: ما هو عنصر التحكم الإيجابي لفيروس SARS-CoV-2 المضمن في المجموعة؟ ج: عنصر التحكم الإيجابي لفيروس SARS-CoV-2 (N2117) هو بلازميد يحتوي على جين N الخاص بفيروس SARS-CoV-2 (GenBank: MN908947.3). يبلغ تركيزه عند 12.5 ضعفًا حوالي مليون نسخة/ميكرولتر، ويتم تقييم كل دفعة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). يُرجى ملاحظة أننا لا نوصي باستخدام تركيز عنصر التحكم الإيجابي كعدد نسخ مطلق للتجارب الكمية. س: كيف تُفسَّر النتائج في مجموعة أدوات Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit؟ أ: عينة 2019-nCoV N1 (HEX) 2019-nCoV N2 (FAM) عنصر التحكم الداخلي (Cy5) التفسير عنصر تحكم إيجابي Cq<27 Cq<27 ND اجتازت مراقبة الجودة عنصر تحكم سلبي ND ND ND اجتازت مراقبة الجودة عينة الاختبار ND ND ND اختبار غير صالح (فشل عنصر التحكم الداخلي) Cq<40 ND Cq<40 غير حاسم - إعادة الاختبار ND Cq<40 Cq<40 غير حاسم - إعادة الاختبار Cq<40 Cq<40 Cq<35 أو ND* إيجابي ND (أو Cq>40) ND (أو Cq>40) Cq<35 سلبي * من المهم ملاحظة أنه عندما تحتوي عينة الاختبار على الحمض النووي الريبي الفيروسي ولكن مع عدد قليل فقط من الخلايا الجسدية أو لا تحتوي على أي منها، فمن الممكن ملاحظة إشارات تضخيم N1 وN2 إيجابية (Cq < 40) وإشارة RNase P سلبية (Cq > 35) بسبب تنافس الهدف. تُعتبر هذه العينة إيجابية. س: ما مدى استقرار مزيج البادئات في مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit؟ ج: مزيج البادئات/المجسات لفيروس SARS-CoV-2 (N1/N2/RP) مستقر وفعال في ظل ظروف الاستخدام والتداول القياسية. وللحصول على أفضل النتائج، يُنصح بتخزين المواد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية عند عدم استخدامها. وقد أظهرت اختبارات الاستقرار، التي شملت ما يصل إلى 30 دورة تجميد/إذابة، عدم وجود أي تأثير سلبي على أداء مزيج البادئات/المجسات. س: ما أنواع العينات/المواد المتوافقة مع مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit؟ ج: خضعت هذه المجموعة لتقييمات مكثفة باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي النقي أو الحمض النووي الكلي المُستخلص في ماء خالٍ من النيوكلياز أو محاليل الاستخلاص الشائعة. يجب ألا يتجاوز حجم المادة المُستخلصة في محلول AVE 13 ميكرولتر (65% حجم/حجم) من حجم التفاعل النهائي. يجب ألا تتجاوز كمية المادة المُستخلصة في محلول TE أو محلول استخلاص مشابه 5 ميكرولتر (25% حجم/حجم) من حجم التفاعل النهائي. أما المادة المُستخلصة في محلول PBS، فيجب ألا تتجاوز 2 ميكرولتر (10% حجم/حجم) من حجم التفاعل النهائي. س: ما هي الأجهزة المتوافقة مع مجموعة Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit؟ ج: مجموعة أدوات Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit متوافقة مع الأجهزة التالية: Applied BioSystems® 7500 Fast، Applied BioSystems® QuantStudio 6/7، Applied BioSystems® QuantStudio 12K، Bio-Rad CFX384/CFX96، Bio-Rad IQ™5، Cepheid Smartcycler™/Smartcycler™ II، Eppendorf Mastercycler®، Qiagen Rotor-Gene® Q/ Rotor-Gene® 6000، Roche LightCycler® 480، Roche LightCycler® 1536، Roche LightCycler® Nano. س: ما هي تسلسلات البادئات والمجسات المضمنة في المجموعة؟ ج: اسم التمهيدي التمهيدي الأمامي مسبار التمهيدي العكسي 2019-nCoV_N1 5 ′ GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT 3 ′ 5 ′ TCT GGT TAC TGC CAG TTG AAT CTG 3 ′ 5 ′ HEX-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-Q 3 ′ 2019-nCoV_N2 5 ′ TTA CAA ACA TTG دول مجلس التعاون الخليجي GCA AA 3 ′ 5 ′ GCG CGA CAT TCC GAA GAA 3 ′ 5 ′ 6-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-Q 3 ′ RNase P 5 ′ AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 3 ′ 5 ′ CAA CTG AAT AGC CAA GGT GAG C 3 ′ 5 ′ Cy5-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-Q ملاحظة 3′: Q = مُثبِّط. س: هل يُمكنني تحضير الصفيحة مُسبقًا؟ ج: عادةً، نوصي بإجراء تفاعلات RT-qPCR في أسرع وقت مُمكن بعد تجهيزها. مع ذلك، استنادًا إلى الاختبارات التي أُجريت باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي المُنقّى في فحوصات 96 بئرًا (حجم التفاعل 20 ميكرولتر)، يُمكن تجهيز تفاعلات Luna RT-qPCR وحمايتها من الضوء لمدة تصل إلى 8 ساعات عند 25 درجة مئوية مع الحفاظ على أداء مُماثل لتفاعلات التحكم. لوحظت نتائج مُشابهة عند اختبار فحوصات 384 بئرًا (حجم التفاعل 10 ميكرولتر). عند تحضير فحوصات 96 بئرًا (حجم التفاعل 20 ميكرولتر) مُسبقًا مع جميع المكونات باستثناء عينة الإدخال، لاحظنا أداءً مُماثلًا عند تخزين مزيج التفاعل المُسبق (الخطوة 4 في البروتوكول/الدليل) لأكثر من 48 ساعة عند 4 درجات مئوية (مُحميًا من الضوء) مُقارنةً بتفاعلات التحكم التي أُجريت مُباشرةً بعد تجهيز التفاعل.