نيو إنجلاند بيولابس، E3025S، مجموعة LunaScript® RT Master Mix (خالية من البادئ)

تتميز مجموعة LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات) بمزيج رئيسي مُحسَّن بتركيز 5X يحتوي على جميع المكونات اللازمة لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى، باستثناء البادئات. الفئات ذات الصلة : Luna® qPCR وRT-qPCR، وRT-PCR، وتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات: RT-PCR، وتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، والنسخ العكسي (تخليق الحمض النووي التكميلي). الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني استخدام عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقَّاة من ظروف تخزين مختلفة، مثل RNALater، في تفاعلات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام LunaScript®؟ ج: بشكل عام، تعمل عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقَّاة من مصادر مختلفة بشكل جيد مع منتجات LunaScript. نوصي عادةً بتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام طرق تعتمد على الأعمدة (مثل مجموعة Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010S)). س: هل يمكنني إعداد تفاعل تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) في درجة حرارة الغرفة عند استخدام LunaScript® RT SuperMix؟ ج: نعم. يمكن إجراء تفاعلات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام LunaScript في درجة حرارة الغرفة. س: هل يمكنني استخدام منتجات LunaScript® cDNA مباشرةً في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)؟ ما هي الكمية التي يمكنني استخدامها للكشف في تفاعل qPCR؟ ج: يمكن استخدام منتج cDNA مباشرةً في تفاعل qPCR. بشكل عام، نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من منتج cDNA في حجم تفاعل qPCR يبلغ 20 ميكرولتر. عند الحاجة، يمكن استخدام ما يصل إلى 20% من حجم تفاعل qPCR كمنتج cDNA غير مخفف (على سبيل المثال، 4 ميكرولتر من منتج cDNA في حجم تفاعل qPCR يبلغ 20 ميكرولتر). س: ما هي كمية قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يجب استخدامها في تفاعلات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام LunaScript®؟ ج: تعمل خلطات LunaScript بشكل جيد مع قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) النقية، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الكلي، والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، وعينات النسخ المختبرية. الكمية في تفاعل 20 ميكرولتر: إجمالي الحمض النووي الريبوزي ≤ 1 ميكروغرام، الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين ≤ 1 ميكروغرام، النسخ المخبرية 100 نانوغرام. س: كيف يُخزَّن منتج LunaScript® cDNA؟ ج: يُمكن تخزين منتج cDNA عند 4 درجات مئوية للاستخدام قصير المدى. أما للتخزين طويل المدى، فيُفضَّل تخزينه عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. س: كيف أختار بين طريقة RT-qPCR أحادية الخطوة أو ثنائية الخطوة؟ ج: تتوفر طريقتان لتحديد كمية عينات الحمض النووي الريبوزي: RT-qPCR أحادية الخطوة وثنائية الخطوة. في كلتا الحالتين، يُنسخ الحمض النووي الريبوزي عكسيًا إلى cDNA، والذي يُستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم qPCR. يُمكن إجراء النسخ العكسي بشكل منفصل عن qPCR (أي RT-qPCR ثنائية الخطوة) أو مباشرةً في مزيج qPCR (أي RT-qPCR أحادية الخطوة). تُفضّل عادةً إجراءات العمل أحادية الخطوة في فحوصات التشخيص الجزيئي، حيث قد تكون كمية العينات محدودة أو عند فحص عينات عديدة. يُفضّل استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي ثنائي الخطوة (RT-qPCR) عند إجراء عدة تحليلات على نفس المادة الأولية أو عند الحاجة إلى أرشفة الحمض النووي التكميلي (cDNA). لمزيد من التفاصيل، يُرجى الرجوع إلى "اختيار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي أحادي الخطوة أو ثنائي الخطوة". سؤال: هل يجب تضمين تفاعل تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (RT) عند إعداد تفاعل تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ جواب: نعم. عند وجود الحمض النووي الجينومي أو نواتج النقل، قد تتداخل مع التحديد الكمي الدقيق للحمض النووي الريبوزي (RNA)، خاصةً للأهداف ذات النسخ المنخفضة. لذلك، من المهم إجراء تفاعلات التحكم المناسبة بدون إنزيم النسخ العكسي (No-RT) لمراعاة هذه التأثيرات. بالإضافة إلى ذلك، يجب إعداد تفاعلات تحكم بدون قالب (NTC) لإثبات أن التفاعلات الإيجابية ذات دلالة. يُرجى الرجوع إلى مجموعة LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010) إذا كنت بحاجة إلى مزيج تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (No-RT). س: ما هي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التي توصون بها للكشف عن منتجات الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: خضعت منتجات الحمض النووي المكمل (cDNA) المُنتجة باستخدام مزيج LunaScript® لتقييمات مكثفة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام مزيج Luna® Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) ومزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004). يوفر هذان المنتجان معًا سير عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) من خطوتين بحساسية ممتازة وقياس كمي خطي دقيق. بالإضافة إلى ذلك، يتوافق LunaScript مع مزيجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التجارية الرئيسية الأخرى. س: لماذا أحصل على كميات قليلة من الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: هناك عدة أسباب لانخفاض كمية الحمض النووي المكمل (cDNA). إليك بعض الاقتراحات لتحسين الكمية: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز المُشوه أو باستخدام جهاز BioAnalyzer (Agilent). يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) كامل الطول. يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي (RNA) نسبة امتصاص ضوئي لا تقل عن 1.7 عند طول موجي 260 نانومتر إلى 280 نانومتر، أو رقم RIN أكبر من 8. يمكن إزالة الملوثات مثل EDTA والجوانيدينيوم عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسله بإيثانول 70%. كما يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب بكلوريد الليثيوم. ويمكن إزالة البروتينات الملوثة، مثل البروتيازات، عن طريق خطوة تنقية الحمض النووي الريبوزي باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي أو الاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم. يُنصح بزيادة كمية الحمض النووي الريبوزي المستخدم، خاصةً للحمض النووي الريبوزي ذي الوفرة المنخفضة. س: هل يؤثر الصبغ الأزرق في LunaScript® RT SuperMix على عملية الكشف؟ ج: تحتوي منتجات LunaScript على صبغة مرجعية بصرية خاملة تُعطي المزيج لونًا أزرقًا واضحًا. يُسهّل هذا اللون تتبع إعداد التفاعل من خلال تحديد وجود أو عدم وجود تفاعلات الحمض النووي التكميلي (cDNA) واختلافات حجمها داخل الأنابيب، وأطراف الماصات، وتفاعلات qPCR اللاحقة. تم تقييم الصبغة الزرقاء على نطاق واسع في تجارب تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، ولم يُلاحظ أنها تُثبط أو تتداخل مع الكشف عن الحمض النووي الريبي (RNA). س: كيف أختار من بين مجموعات تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من شركة NEB؟ ج: يُبرز الجدول 1 المزايا والتطبيقات الرئيسية لمجموعات تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من شركة NEB. مجموعات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010) مجموعة LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (NEB #E3025) مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560) المكونات: LunaScript RT SuperMix (5X)* مزيج التحكم بدون RT (5X)* ماء خالٍ من النيوكلياز *يحتوي كلا المزيجين على سداسي النيوكليوتيدات وd(T)10 LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (5X) مزيج التحكم بدون RT (خالية من البادئات) (5X) ماء خالٍ من النيوكلياز ProtoScript II Enzyme Mix (10X) ProtoScript II Reaction Mix (2X) Oligo d(T)23VN (50 ميكرومولار) مزيج البادئات العشوائية (60 ميكرومولار) ماء خالٍ من النيوكلياز التنسيق التطبيق الموصى به البادئات الحضانة لـ RT-qPCR ثنائي الخطوات الكشف باستخدام سداسي النيوكليوتيدات وd(T)10: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. للكشف باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) ثنائي الخطوات: مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام: d(T)23VN أو بادئات خاصة بالجين: 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام: d(T)23VN أو بادئات خاصة بالجين: 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة؛ 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. مزيج البادئات العشوائية: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ٨٠ درجة مئوية ٥ دقائق المزايا ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ مؤشر تتبع مرئي ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ حجم أكبر من الحمض النووي الريبوزي المدخل ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ مؤشر تتبع مرئي ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ حجم أكبر من الحمض النووي الريبوزي المدخل ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ كل شيء متضمن اتبع شجرة القرار أدناه لاختيار مجموعة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) للسلسلة الأولى بناءً على تطبيقاتك اللاحقة. الشكل ١. يدعم مزيج LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات) العديد من التطبيقات. بإضافة بادئات مختلفة، بما في ذلك مزيج البادئات العشوائي، وd(T)23VN، والسداسيات العشوائية، يمكن أن يكون الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتج بواسطة مزيج LunaScript RT Master Mix مناسبًا تمامًا للتطبيقات اللاحقة مثل الكشف بتقنية RT-qPCR، وRT-PCR، ودراسات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq). س: عند استخدام منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) من LunaScript في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) اللاحق (أي تفاعل البلمرة المتسلسل العكسي ثنائي الخطوات)، ما هي الأحجام ومنتجات تفاعل البلمرة المتسلسل التي يمكن استخدامها؟ ج: منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) من تفاعلات LunaScript متوافقة مع العديد من كواشف تفاعل البلمرة المتسلسل. عادةً، نوصي باستخدام OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 أو NEB #M0485) للكشف عن الحمض النووي التكميلي (PCR) حتى 5 كيلوبايت، وQ5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) للحصول على أعلى دقة، وLongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) للحصول على إنتاجية عالية من منتجات أطول. اعتمادًا على الأهداف/البادئات، قد يختلف حجم الحمض النووي التكميلي (cDNA) الأمثل ويجب تحسينه، ولكن عادةً، نوصي باستخدام 1 ميكرولتر من تفاعل الحمض النووي التكميلي (cDNA) كمدخل في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بحجم 25 ميكرولتر. عند الحاجة، يمكن إضافة ما يصل إلى 20% من حجم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (مثلاً، 5 ميكرولتر من ناتج الحمض النووي المكمل (cDNA) في تفاعل PCR بحجم 25 ميكرولتر). س: كيف أختار البادئات لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) باستخدام مزيج LunaScript RT Master Mix (بدون بادئات)؟ ج: يعتمد اختيار البادئة المثلى لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) على التطبيق النهائي المطلوب. تطبيقات ما بعد المعالجة: البادئات، الهدف: تحديد كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، مزيج البادئات العشوائية (NEB #S1330S)، التوصية النموذجية: 6 ميكرومتر نهائي، تغطية متساوية، تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) العام، أوليغو d(T)23VN (NEB #S1327S)، التوصية النموذجية: 5 ميكرومتر نهائي، تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) كامل الطول، مزيج البادئات العشوائية أو البادئة العشوائية، التوصية النموذجية: 6 ميكرومتر نهائي، تغطية متساوية، بادئة خاصة بالجين، التوصية النموذجية: 0.5 ميكرومتر نهائي (المدى: 0.1 - 1 ميكرومتر)، الحمض النووي المكمل (cDNA) الخاص بالهدف. س: هل يمكنني استخدام مزيج LunaScript RT Master Mix في سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)؟ ج: يتوافق مزيج LunaScript RT Master Mix مع أنواع مختلفة من البادئات، بما في ذلك البادئات العشوائية وبادئات أوليغو-dT. بالنسبة لمعظم سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)، يمكن دمج مزيج LunaScript RT Master Mix كخطوة لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA). س: ما هي درجة الحرارة المناسبة لتفاعل تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) باستخدام LunaScript®؟ ج: يدعم إنزيم النسخ العكسي Luna® المقاوم للحرارة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بكفاءة عالية عند درجات حرارة مرتفعة مقارنةً بإنزيم النسخ العكسي MMLV RT. بالنسبة لمعظم الأهداف، يمكن إتمام تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بحضانة لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. أما بالنسبة للقوالب الصعبة، فيمكن رفع درجة حرارة تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) إلى 65 درجة مئوية. س: كيف أختار بين إنزيم النسخ العكسي Induro ومنتجات LunaScript وProtoScript المختلفة؟ ج: إنزيم النسخ العكسي Induro هو إنزيم نسخ عكسي مشفر بواسطة إنترون من المجموعة الثانية، وهو مفيد لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من النسخ الطويلة، والحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي تحتوي على مثبطات. في المقابل، تُعد كواشف LunaScript عبارة عن مزيج رئيسي. يُعد مزيج LunaScript RT الرئيسي (خالٍ من البادئات) (NEB #E3025) مناسبًا لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) بشكل عام. منتجات LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) مُحسّنة لسير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات، حيث لا تتطلب سوى منتجات cDNA قصيرة. كما تُستخدم LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل ARTIC SARS-CoV-2. يوضح هذا الجدول تطبيقات وميزات كل منتج. منتجات النسخ العكسي الفيروسي الرجعي المشفر بالإنترونات: إنزيم النسخ العكسي Induro™ (NEB #M0681)، مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010)، مجموعة LunaScript RT SuperMix (NEB #M3010)، مجموعة LunaScript RT Master Mix (NEB #E3025)، مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560). التطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) الطويل، عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) غير النقية، تطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (مثل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبوزي، وتسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) طويل القراءة، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA seq)، الكشف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) على مرحلتين، بروتوكول قصير. ✓ خيارات مرنة من البادئات، و dNTPs المعدلة ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ تتضمن المجموعة جميع المكونات اللازمة. س: كيف أعرف ما إذا كان قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بي ذو جودة جيدة؟ ج: يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. تشير نسبة الامتصاص عند A260/A280 التي تزيد عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8 على جهاز BioAnalyzer عادةً إلى جودة عالية للحمض النووي الريبوزي (RNA).