مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E3031S، لونا® سيل ريدي بروبس ون-ستيب RT-qPCR

انتقل مباشرةً من الخلايا إلى قياس كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) دون تنقية. الفئات ذات الصلة : Luna® qPCR وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتقنيات التضخيم. التطبيقات: qPCR وRT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ثنائي الخطوة، تضخيم الحمض النووي، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل وqPCR. المواد المطلوبة (غير متوفرة ): محلول ملحي فوسفاتي (PBS)، بادئات خاصة بالهدف، خلايا، أنابيب إيبندورف، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل، صفائح تفاعل البوليميراز المتسلسل، جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، ماصات وأطراف ماصات (لتقليل التلوث المتبادل، يُنصح باستخدام أطراف مرشحة). الأسئلة الشائعة: س: ما هي سلالات الخلايا المتوافقة مع مجموعة Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR؟ ج: يمكن استخدام العديد من سلالات الخلايا للكشف المباشر عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعة Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR. ومع ذلك، قد تحتوي بعض سلالات الخلايا على مستويات عالية من المثبطات التي قد تؤثر على تحلل الخلايا أو تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR). يمكن أن يؤثر وسط الاستنبات ومعالجة الأدوية/RNAi/CRISPR أيضًا على حالة نمو الخلايا ومستويات المثبطات. يوضح الجدول أدناه النتائج الملاحظة مع خطوط خلايا ثديية مختلفة باستخدام سلسلة تخفيف 5 لوغاريتمية (100,000 - 10 خلايا لكل 50 ميكرولتر من التحلل)، والكشف اللاحق عن 1 ميكرولتر من المحلول في تجربة RT-qPCR أحادية الخطوة بحجم 20 ميكرولتر. لكل خط خلوي، تُشار إلى النتائج الخطية في العمود الأخير من الجدول أدناه. بالإضافة إلى خطوط الخلايا الثديية هذه، فإن المجموعة متوافقة أيضًا مع خطوط خلايا الحشرات. بالنسبة لخطوط الخلايا غير المدرجة أدناه، يُوصى بإجراء اختبار تجريبي لتحديد العدد الأمثل للخلايا المدخلة للتحلل، بالإضافة إلى كمية المحلول التي يمكن إدخالها في RT-qPCR. خطوط الخلايا الخاصية النوع عدد الخلايا لكل 50 ميكرولتر من المحلول HeLa خلايا ملتصقة Hs. عنق الرحم، سرطان غدي 10-100,000 A549 خلايا ملتصقة Hs. الرئة، سرطان 10-100,000 خلية معلقة من خلايا جركات. الخلايا اللمفاوية التائية، سرطان الدم 10-100,000 خلية HEK293 ملتصقة. الكلى 10-100,000 خلية U2Os ملتصقة. العظام، ساركوما عظمية 10-100,000 خلية HepG2 ملتصقة. الكبد، سرطان 10-1,000 خلية K-562 معلقة. الخلايا اللمفاوية، سرطان الدم 10-100,000 خلية NCI-H460 ملتصقة. الرئة، سرطان 10-100,000 خلية SK-N-SH ملتصقة. الدماغ، ورم أرومي عصبي 10-10,000. س: كم عدد الخلايا التي يجب استخدامها للكشف الموثوق؟ ج: تتميز وحدة تحليل الخلايا الجاهزة من لونا بقدرة تحليل تتراوح بين 10 و100,000 خلية في تفاعل تحليل حجمه 50 ميكرولتر. عادةً، يمكن نقل 1-2 ميكرولتر من مستخلص الخلية (ما يعادل الحمض النووي الريبوزي من 0.2 إلى 4,000 خلية) إلى تفاعل RT-qPCR بحجم 20 ميكرولتر. يمكن الكشف عن معظم النسخ من 20 إلى 200 خلية في تفاعل نموذجي بحجم 20 ميكرولتر. مع ذلك، قد تحتوي بعض سلالات الخلايا على مستويات عالية من مثبطات تحليل الخلايا أو تفاعلات RT-qPCR. لإجراء فحص سريع للتعبير الجيني، يُعدّ تحليل حوالي 1000 خلية لكل 50 ميكرولتر نقطة بداية جيدة للتحسين. يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة الإضافية للحصول على إرشادات بشأن سلالات الخلايا المحددة. يمكن أيضًا تحليل العينات الثمينة التي تحتوي على عدد قليل من الخلايا (≤10) باستخدام وحدة تحليل الخلايا الجاهزة من لونا، مع الكشف اللاحق باستخدام مجموعة لونا العالمية للكشف عن RT-qPCR. مع ذلك، يلزم تعديل مزيج تحلل الخلايا كما هو موضح أدناه. يُنصح بإجراء تجارب أولية لتحسين سير العمل بالكامل قبل استخدام عينات ثمينة/محدودة. المكونات: الحجم الكلي (25 ميكرولتر): محلول تحلل الخلايا Luna Cell Ready (2X) 12.5 ميكرولتر، ديوكسي ريبونيوكلياز I (خالٍ من الريبونيوكلياز) (10X) 2.5 ميكرولتر، كاشف حماية الحمض النووي الريبي Luna Cell Ready 2.5 ميكرولتر، بروتياز Luna Cell Ready 0.25 ميكرولتر، محلول إيقاف Luna Cell Ready 2.5 ميكرولتر، خلايا (متغير، حتى 2.5 ميكرولتر)، ماء خالٍ من الريبونيوكلياز حتى الوصول إلى حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر. س: ما عدد الخلايا التي يجب زرعها في أطباق زراعة الخلايا لتحقيق أفضل كشف؟ ج: باتباع إرشادات زراعة الخلايا العامة، لا تزرع خلايا تتجاوز متوسط ​​الإنتاجية لكل بئر عند كثافة 100% (راجع إرشادات الشركات المصنعة، الجدول أدناه مُعدّل من شركة Corning Inc. كمثال). ضع في اعتبارك أن الخلايا قد تستمر في الانقسام بعد الزراعة. تأكد من أن عدد الخلايا عند الحصاد ضمن قدرة التحلل. بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد إجراء اختبار أولي في تحديد النطاق الأمثل لكمية الخلايا المدخلة لسلالات الخلايا أو المضخمات الخاصة بك. أطباق زراعة الخلايا، متوسط ​​الإنتاجية (عند 100% من التغطية): 6 آبار: 9.5 × 10⁵، 12 بئراً: 3.8 × 10⁵، 24 بئراً: 1.9 × 10⁵، 48 بئراً: 0.95 × 10⁵، 96 بئراً: 3.2 × 10⁴، 384 بئراً: 5.6 × 10³. س: هل يمكن استخدام سلالات الخلايا المحفوظة بالتجميد أو الخلايا المترسبة المخزنة عند -80 درجة مئوية مع هذه المجموعة؟ ج: نعم، وحدة تحلل الخلايا الجاهزة من لونا متوافقة مع الخلايا المحفوظة بالتجميد بشرط الحفاظ على حيوية الخلايا. إذا كان سيتم استخدام كريات الخلايا المجمدة بشكل روتيني، فيُفضل تقسيم العدد المطلوب من الخلايا إلى حصص قبل ترسيبها وتجميدها، إن أمكن. س: كيف يمكن تحديد كفاءة التحلل؟ ج: لتحديد كفاءة التحلل، يجب تقييم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) عبر تخفيف الخلايا بمقدار 5 لوغاريتمات. أعد تعليق الخلايا في محلول إعادة تعليق الخلايا، وقم بتحليل 10 إلى 100,000 خلية لكل 50 ميكرولتر من التفاعل. قم بإجراء تفاعل RT-qPCR أحادي الخطوة باستخدام مستخلصات الخلايا، وتحقق من كفاءة RT-qPCR باستخدام جين مُستهدف (يجب التحقق من صحة الهدف/البادئات باستخدام الحمض النووي الريبي النقي أولاً). يجب أن تتراوح الكفاءة المثالية بين 90% و110%. غالبًا ما تشير الكفاءة الأقل من 90% إلى تلف الحمض النووي الريبي. قد تشير الكفاءة الأعلى من 110% مع تأخر قيمة العتبة الأولية (Cq) إلى وجود مثبطات محتملة في تفاعل RT-qPCR. س: لماذا من المهم تقييم تلف الحمض النووي الريبي أو تثبيطه أثناء تحلل الخلايا والكشف عنه في تفاعل RT-qPCR أحادي الخطوة؟ ج: عند التركيزات العالية، قد تُلحق بعض مكونات الخلية الضرر بالحمض النووي الريبوزي (RNA) أو تُثبّط تحلل الخلايا وخطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR)، مما يؤدي إلى قياس غير دقيق لتعبير الحمض النووي الريبوزي. في وجود كاشف حماية الحمض النووي الريبوزي Luna Cell Ready، يمكن تقليل تلف الحمض النووي الريبوزي بشكل كبير. يمكن استخدام طريقتين لتقييم الأداء السليم لسير عمل Luna Cell Ready: 1) إضافة حمض نووي ريبوزي مرجعي عند تحضير مزيج تحلل الخلايا. (قارن قيم العتبة الكمية (Cq) للحمض النووي الريبوزي المرجعي في وجود الخلايا أو غيابها. تشير قيم العتبة الكمية المتقاربة (فرق ≤ 1 Cq) إلى تلف محدود للحمض النووي الريبوزي وتثبيط ضئيل لتفاعلات RT-qPCR. يُوصى باستخدام حمض نووي ريبوزي مرجعي لا يُظهر تشابهًا مع مجموعة الحمض النووي الريبوزي. على سبيل المثال، إذا كنت تعمل مع خطوط خلايا بشرية، فقد يكون الحمض النووي الريبوزي لفيروس لامدا المُستنسخ في المختبر خيارًا مناسبًا.) 2) إجراء تفاعل RT-qPCR بخطوة واحدة باستخدام حمض نووي ريبوزي كلي مُنقّى يُعادل تقريبًا كمية الحمض النووي الريبوزي في مُستخلص الخلية. على سبيل المثال، عند حصاد الخلايا، يمكن استخدام نصف الكمية لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعة أدوات تعتمد على الأعمدة (مثل مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit، NEB#T2010S)، بينما يُحضّر النصف الآخر باستخدام وحدة Luna Cell Ready Lysis Module. تشير قيم Cq المتشابهة إلى تحلل فعال للخلايا. في حال عدم التحلل، يُنصح بتقليل عدد الخلايا حتى الحصول على نتائج مماثلة. س: ما هو "كاشف حماية الحمض النووي الريبوزي Luna Cell Ready" ومتى يُستخدم؟ ج: أثناء تحلل الخلايا، تُطلق النيوكليازات الداخلية التي قد تُحلل الحمض النووي الريبوزي الخلوي بشكل غير انتقائي. تم تحسين كاشف حماية الحمض النووي الريبوزي Luna Cell Ready للحد من تحلل الحمض النووي الريبوزي أثناء عملية تحلل الخلايا. نوصي بإضافة كاشف حماية الحمض النووي الريبوزي Luna Cell Ready إلى عملية إعادة تعليق الخلايا وتخفيفها وتحللها (كما هو موضح في الدليل) لتقليل تلف الحمض النووي الريبوزي. س: هل يجب عليّ تضمين تفاعل تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (No-RT)؟ ج: تُعدّ تفاعلات التحكم بدون إنزيم النسخ العكسي مفيدة لتحديد المشكلات التي قد تنشأ عن تضخيم الحمض النووي الجينومي الموجود في العينة. بشكل عام، توفر مجموعة Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR إزالة فعّالة للحمض النووي الجينومي (>95%). على سبيل المثال، مع وجود نسخة جينية وفيرة مثل β-actin، يتم الكشف عن الحمض النووي الجينومي بعد حوالي 10 دورات من الكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) بعد إزالة الحمض النووي. مع ذلك، توجد العديد من نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) بكميات قليلة. بالنسبة لهذه النسخ، يُنصح بإجراء تفاعل تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي، خاصةً إذا لم تغطِ مجموعات البادئات وصلات الإكسونات. بالإضافة إلى ذلك، يجب تضمين تفاعلات تحكم بدون قالب (NTC) لإثبات أن النتائج الإيجابية ذات دلالة. س: هل سيتداخل صبغ التتبع الأزرق مع عملية الكشف؟ ج: يحتوي محلول التحلل Luna Cell Ready Lysis Buffer على صبغة مرجعية بصرية خاملة. تُسهّل هذه الصبغة مراقبة إعداد التفاعل وضمان النقل المناسب للسائل بين أطباق التحلل وأطباق RT-qPCR. تم تقييم الصبغة الزرقاء على نطاق واسع في تفاعل تحلل الخلايا وتجارب RT-qPCR، ولم يُلاحظ أي تثبيط أو تداخل. س: هل غسل الخلايا قبل التحلل ضروري؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي بغسل الخلايا للتخلص من الوسط غير المرغوب فيه والخلايا الميتة. مع ذلك، في الحالات التي لا يكون فيها ذلك عمليًا، مثل الفحص عالي الإنتاجية أو دراسات التعبير الجيني شديدة الحساسية حيث قد يؤدي غسل الخلايا إلى تغيير وفرة الحمض النووي الريبوزي (RNA)، يمكن استخدام قلب الطبق لإزالة الوسط بفعالية. في حال حذف خطوة الغسل، يجب استخدام المستخلصات فورًا، دون دورات تجميد وإذابة. س: ما هي طريقة التحلل التي يجب استخدامها؟ ج: بالنسبة للخلايا الملتصقة النامية في الأطباق، يمكن إجراء التحلل في الطبق لتبسيط سير العمل وتقليل فقدان الخلايا. بالنسبة للخلايا غير الملتصقة، تُعلق الخلايا في محلول إعادة تعليق الخلايا ويُحلل حجم مناسب (راجع البروتوكول لمزيد من التفاصيل). س: ما هو البروتوكول الذي يجب استخدامه لتحلل الخلايا؟ هل يمكن تحلل الخلايا في درجة حرارة الغرفة أو باستخدام بروتوكول قصير؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام بروتوكول تحلل قياسي لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، يليه تعطيل لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. مع ذلك، تم اختبار درجات حرارة تحلل تتراوح بين 25 و37 درجة مئوية باستخدام وحدة Luna Cell Ready Lysis Module. إذا كان عدد الخلايا أقل من 10000 خلية (لكل 50 ميكرولتر من تفاعل التحلل)، يمكن أيضًا استخدام 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. على الرغم من أن المدة الموصى بها لتحلل الخلايا هي 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، فقد تم اختبار فترات حضانة تتراوح بين 5 و20 دقيقة. تُعد فترة الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مقبولة لإطلاق الحمض النووي الريبوزي (RNA) إذا لم تكن إزالة الحمض النووي الجينومي أولوية قصوى. يُرجى ملاحظة أنه لا ينبغي تقليل مدة خطوة التعطيل اللاحقة (5 دقائق). استخدم المُستخلص فورًا أو احفظه على الجليد واستخدمه في غضون 5 ساعات. س: عند استخدام مُستخلصات الخلايا المُنتجة من وحدة Luna Cell Ready Lysis Module، هل يمكن إعداد تجارب RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم، يمكن إجراء تفاعل RT-qPCR في درجة حرارة الغرفة. مع ذلك، فإن مستخلصات الخلايا حساسة لدرجة الحرارة؛ لذا يُفضل حفظها على الثلج أثناء تحضير التفاعل. بمجرد تجهيز لوحة RT-qPCR، ابدأ التفاعلات في أسرع وقت ممكن. في حال الحاجة إلى تخزين لوحة RT-qPCR لفترة قصيرة، احفظها عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 5 ساعات للكشف باستخدام الصبغة. أما للكشف باستخدام المجس، فيجب إجراء تجربة RT-qPCR فورًا بعد التحضير. وللفحص عالي الإنتاجية باستخدام الأتمتة، قلل مدة بقاء المستخلصات في درجة حرارة الغرفة (لا تزيد عن 15 دقيقة قبل بدء العملية)، وتجنب دورات التجميد والذوبان. س: ما كمية مستخلص الخلايا التي يجب استخدامها كمدخل؟ (NEB #3031) ج: تعتمد كمية مستخلص الخلايا التي يمكن إضافتها إلى تفاعل RT-qPCR أحادي الخطوة على مجموعة أدوات RT-qPCR المستخدمة. عند استخدام مجموعة Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR، يمكن أن يشكل مستخلص الخلايا ما يصل إلى 10% من إجمالي حجم التفاعل، وبحد أقصى 4000 خلية لكل 20 ميكرولتر من تجربة RT-qPCR. س: هل يمكنني استخدام مستخلصات الخلايا الناتجة من وحدة Luna Cell Ready Lysis لإجراء RT-qPCR على مرحلتين؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام مستخلصات الخلايا في RT-qPCR على مرحلة واحدة. إذا كنت تخطط لاستخدام مستخلصات الخلايا في RT-qPCR على مرحلتين، يُنصح بإجراء تجارب أولية لتحسين كمية مستخلصات الخلايا. يُعدّ حوالي 200 خلية لكل 20 ميكرولتر من تفاعل النسخ العكسي نقطة بداية جيدة للتحسين. س: لماذا تحتوي مجموعة Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR على عدد أكبر من تفاعلات RT-qPCR مقارنةً بتفاعلات التحلل؟ ج: تتضمن مجموعة Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR وحدة تحلل تحتوي على 100 تفاعل تحلل ووحدة One-Step RT-qPCR تحتوي على 500 تفاعل. يعتمد هذا الاقتران على إعداد تجريبي نموذجي حيث يمكن للمستخدم إجراء نسخ متعددة من نسخة جينية محددة (بالإضافة إلى نسخة مرجعية) مع ضوابط مناسبة بدون إنزيم النسخ العكسي. بشكل متحفظ، يكفي تفاعل تحلل خلوي بحجم 50 ميكرولتر لإجراء 40 تفاعل RT-qPCR على الأقل، بافتراض استخدام 1 ميكرولتر من المستخلص لكل تفاعل. قم بزيادة حجم تفاعلات التحلل وفقًا لذلك إذا كنت تخطط لإجراء المزيد من تفاعلات RT-qPCR. يمكن طلب كل من وحدة Luna Cell Ready Lysis (NEB #E3032) ومجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (NEB #E3006) بشكل منفصل عند الحاجة. س: إذا نفدت وحدة Luna Cell Ready Lysis أو مجموعة Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR، فهل يمكنني طلبهما بشكل منفصل؟ ج: نعم. يمكن طلب كلا الوحدتين بشكل منفصل. وحدة Luna Cell Ready Lysis (NEB #E3032) متوفرة بحجم 100 تفاعل تحلل (50 ميكرولتر). أما مجموعة Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (NEB #E3006) فتأتي بأربعة أحجام (20 ميكرولتر لكل تفاعل): E3006S (200 تفاعل)، E3006L (تفاعل واحد)، E3006X (1000 تفاعل)، وE3006E (2500 تفاعل). يعتمد الأداء العام على كلٍ من وحدة التحلل ومجموعة Probe One-Step RT-qPCR. وللحصول على أفضل النتائج، يُنصح باستخدام الوحدتين معًا. سؤال: كيف يمكنني الحصول على المزيد من المساعدة التقنية المتعلقة بمجموعة Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR؟ جواب: يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة الإضافية ودليل المستخدم الموجود على الموقع الإلكتروني www.neb.com/E3006.