نيو إنجلاند بيولابس، E3313S، مجموعة PURExpress® Δ Ribosome

الفئات ذات الصلة بـ PURExpress: تخليق البروتين في المختبر، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، استخلاص وتنقية الحمض النووي الريبوزي الكلي، تطبيقات PURExpress، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، مواصفات التعبير عن البروتين. المواد المطلوبة (غير متوفرة ): عام: حاضنة 37 درجة مئوية. الوسم: ميثيونين-35S (يوصى بأكثر من 1000 سي/مليمول، درجة ترجمة في المختبر). ترسيب حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك: محاليل حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (25%، 10%)، هيدروكسيد الصوديوم 1 مولار، أحماض أمينية، إيثانول، مرشحات من الألياف الزجاجية، مشعب ترشيح فراغي. SDS-PAGE: هلامات ومحلول تشغيل، جهاز هلام، مصدر طاقة، مجفف هلام. Western Blotting: جهاز نقل، غشاء، أجسام مضادة وكاشف كشف. التنقية: Ni-NTA Agarose، Amicon Ultra- 0.5 مل، Ultracel- 100K، مرشحات طرد مركزي غشائية. الأسئلة الشائعة : س: أين يمكنني العثور على المزيد من الأسئلة الشائعة المفصلة لـ س: ما الفرق بين مجموعة PURExpress E3313S ومجموعة PURExpress E6800S؟ ج: يرجى النقر هنا للاطلاع على مجموعة الأسئلة الشائعة الكاملة الخاصة بـ PURExpress. س: ما الفرق بين مجموعة Δ Ribosome Kit E3313S ومجموعة PURExpress E6800S؟ ج: صُممت مجموعة PURExpress Δ Ribosome Kit لتلبية احتياجات المختبرات التي تُجري دراسات الترجمة باستخدام الريبوسومات الخاصة بها. في مجموعة PURExpress Δ Ribosome Kit، تكفي الريبوسومات الضابطة المرفقة لإجراء تفاعلين. أما مكونات المجموعة الأخرى فتكفي لإجراء 10 تفاعلات. نوصي بشدة، عند استخدام الريبوسومات الخاصة بك، بمعايرة الكمية اللازمة للحصول على أفضل ترجمة للبروتين في تفاعل PURExpress. لمزيد من المعلومات التفصيلية حول الاستخدام، يرجى الرجوع إلى دليل المنتج. س: عند استخدام PURExpress، تمكنتُ من تصنيع البروتين المستهدف، ولكن المنتج كامل الطول ليس النوع السائد؟ ج: بدء الترجمة و/أو إنهاؤها غير صحيحين. يتطلب إنتاج البروتين كامل الطول بدءً وإنهاءً صحيحين. قد تؤدي مواقع دخول الريبوسوم الداخلية و/أو الإنهاء المبكر إلى إنتاج بروتينات مبتورة غير مرغوب فيها. يصعب التحكم في بدء الترجمة عند كودونات AUG غير الأصلية والإنهاء المبكر. في حال وجود العديد من الكودونات النادرة أو احتواء الهدف على نسبة عالية بشكل غير معتاد من حمض أميني معين، فقد يساعد إضافة الحمض النووي الريبوزي الناقل "المفقود". س: عند استخدام PURExpress، لم أتمكن من تصنيع بروتين التحكم؟ ج: تم تعطيل مكونات المجموعة. يلزم تخزين جميع المواد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، ويجب تقليل عدد دورات التجميد والذوبان. تلوث النيوكلياز: لتجنب تلوث النيوكلياز، ارتدِ قفازات واستخدم رؤوسًا وأنابيب خالية من النيوكلياز. نوصي أيضًا بإضافة مثبط RNase (مثل NEB #M0314) إلى التفاعلات. س: عند استخدام PURExpress، تمكنت من تصنيع بروتين التحكم، ولكن عينة الهدف غير موجودة أو موجودة بكمية قليلة؟ أ: تلوث RNase: تُعدّ مجموعات التحضير المصغّرة التجارية أداةً مفيدةً لتحضير قالب الحمض النووي، ولكنها غالبًا ما تكون مصدرًا لإدخال RNase A إلى تفاعل تخليق البروتين في المختبر. غالبًا ما يُتغلّب على هذه المشكلة بإضافة مثبط RNase (NEB #M0314S، 20 وحدة/25 ميكرولتر من حجم التفاعل). تصميم قالب الحمض النووي غير مُناسب: تأكّد من صحة تسلسل قالب الحمض النووي. يجب أن تكون المنطقة المشفرة، بالإضافة إلى التسلسلات التنظيمية، صحيحةً ومتوافقةً مع الإطار لضمان بدء الترجمة بشكلٍ صحيح وإنتاج بروتين كامل الطول. قد تؤثر التسلسلات التنظيمية غير المثلى و/أو التباعد غير المناسب سلبًا على كفاءة الترجمة. يُعدّ بدء الترجمة خطوةً أساسيةً لنجاح تخليق البروتين. قد تُؤدّي البنية الثانوية أو الكودونات النادرة في بداية mRNA إلى إعاقة عملية البدء والتأثير سلبًا على تخليق البروتين. قد تُساعد إضافة منطقة بدء جيدة (مثل الكودونات العشرة الأولى من بروتين ربط المالتوز)، بافتراض إمكانية تحمّل إضافة بقايا إلى التسلسل المستهدف. بدلاً من ذلك، يُمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتعديل الطرف 5' من الجين المستهدف كاستراتيجية ناجحة لإزالة العناصر البنيوية الثانوية أو الكودونات النادرة. قد يكون الحمض النووي القالب ملوثًا، إذ قد يحتوي على مثبطات النسخ أو الترجمة. ستكشف تجربة خلط بسيطة (حمض نووي ضابط + حمض نووي مستهدف، مقارنةً بالحمض النووي الضابط وحده) عن وجود هذه المثبطات. تُقلل المثبطات الموجودة في الحمض النووي المستهدف من كمية البروتين الضابط. تجنب استخدام الحمض النووي المُستخلص من هلام الأغاروز، لأنه غالبًا ما يحتوي على مثبطات للترجمة (مثل بروميد الإيثيديوم). يُعدّ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) المتبقي من بروتوكولات تحضير البلازميد ملوثًا شائعًا آخر، ويمكن إزالته عن طريق استخلاص الفينول:الكلوروفورم والترسيب بالإيثانول. عند إجراء الترسيب بالإيثانول، نوصي باستخدام أسيتات الصوديوم بدلاً من أسيتات الأمونيوم، وهو مثبط معروف للترجمة. احرص على إزالة جميع آثار الإيثانول. يجب أن تكون القوالب المُنتجة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل خالية من نواتج التضخيم غير النوعية. قد تحتوي هذه الملوثات على إشارات نسخ، وبالتالي تتنافس على مكونات النسخ و/أو الترجمة وتستنزفها. ونتيجة لذلك، قد تتأثر كمية الناتج، وقد تُنتج منتجات غير مرغوب فيها ومبتورة. تركيز الحمض النووي القالب ليس مثاليًا. يُعد تركيز الحمض النووي القالب مهمًا لأن تخليق البروتين في المختبر هو توازن بين النسخ والترجمة. يؤدي نقص الحمض النووي القالب إلى تقليل كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المترجم بنشاط، بينما يؤدي فرط تركيزه إلى الإفراط في إنتاج الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) وإرهاق جهاز الترجمة. نوصي باستخدام 250 نانوغرام من الحمض النووي القالب لتفاعل حجمه 25 ميكرولتر. قد يؤدي تحسين التركيز باستخدام كميات مختلفة من الحمض النووي القالب (مثل 25-1000 نانوغرام) إلى تحسين كمية ناتج بروتين مستهدف معين. إذا تم استخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لحساب تركيز الحمض النووي القالب، فضع في اعتبارك أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي الصبغي يمتص أيضًا الأشعة فوق البنفسجية. إذا كانت عينتك تحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي الصبغي، فقد تكون الكمية الفعلية للحمض النووي القالب أقل من الكمية المحسوبة. يجب أن تكون نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى 280 نانومتر 1.8. قد يكشف تحليل عينة من الحمض النووي القالب على هلام الأغاروز عن وجود أحماض نووية أخرى، بالإضافة إلى أي تحلل أو حجم غير صحيح للحمض النووي القالب. س: أين يمكنني العثور على جميع الأسئلة الشائعة حول IMPACT؟ ج: الأسئلة الشائعة حول IMPACT. س: هل توجد مراجع PURExpress؟ ج: نعم. يمكن العثور على مراجع PURExpress هنا.