مجموعة الكشف عن الطفرات EnGen® من شركة New England Biolabs، رقم المنتج E3321S

الفئات ذات الصلة: التحقق من صحة تحرير الجينات بتقنية كريسبر، وإنزيمات إصلاح الحمض النووي، والإنزيمات النووية الداخلية المتخصصة بالبنية . المواد المطلوبة (غير متوفرة) : بادئات أوليغوديوكسي ريبونوكليوتيد لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أنابيب أو شرائح تفاعل PCR، ماء خالٍ من النيوكلياز، جهاز تدوير حراري، رؤوس بخاخ لتفاعل PCR. الأسئلة الشائعة : س: لماذا أرى حزمة إضافية عند تشغيل الحمض النووي الهجين غير المهضوم على هلام الأغاروز؟ ج: في بعض الحالات، يتحرك الحمض النووي الهجين غير المهضوم أبطأ قليلاً من الحمض النووي المتماثل. اعتمادًا على تركيب الطفرات، يمكن أحيانًا رؤية ذلك كحزمة أعلى الحمض النووي المتماثل على هلام الأغاروز. س: لماذا أرى كمية قليلة جدًا من الحمض النووي على الهلام أو إشارة ضعيفة على محلل الشظايا؟ ج: تأكد من كفاية ناتج تفاعل PCR قبل المتابعة بالهضم والتحليل. قم بإجراء تفاعل تحكم للتأكد من أن المجموعة تعمل بشكل صحيح. س: هل يتعرف إنزيم EnGen® T7 Endonuclease I على عدم تطابق قاعدة واحدة أو إدخالات أو حذف قاعدة واحدة (indels)؟ ج: لا يتعرف إنزيم T7 Endonuclease بكفاءة على عمليات الإدخال والحذف أو عدم التطابق التي تقل عن قاعدتين. س: هل يمكن استخدام مستخلصات الخلايا في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ ج: لقد اختبرنا بنجاح مستخلصًا خامًا مُحضرًا باستخدام QuickExtract™ (Epicentre #QE09050) وDNAzol® Direct (Molecular Research Center, INC #DN 131). لا نوصي باستخدام كواشف أخرى. تم تضمين كواشف إضافية لتفاعل البلمرة المتسلسل لتحسين التضخيم. س: ما هي النتائج المتوقعة باستخدام عنصر التحكم المرفق؟ ج: يحتوي مزيج قالب التحكم والبادئ المرفق على بلازميدين، وعند تضخيمهما سينتجان قطعًا مضخمة مع إدخال 10 أزواج قاعدية وبدونه. ستضخم البادئات المضمنة في هذا المزيج منطقة طولها حوالي 600 زوج قاعدي حول هذا الإدخال. بعد فصل سلسلتي الحمض النووي وإعادة ربطهما، ستتشكل في بعض نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) جزيئات هجينة. سيكشف إنزيم T7 Endonuclease I هذه الجزيئات الهجينة ويقطعها لإنتاج شظايا يتراوح طولها بين 200 و400 زوج قاعدي. يمكن الكشف عن هذه الشظايا باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي القياسي أو باستخدام أجهزة تحليل الشظايا. س: ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل لدي منخفض، هل يمكنني إضافة أكثر من 5 ميكرولتر من ناتج التفاعل إلى تفاعل الهضم؟ ج: تم تحسين عملية الهضم لاستخدامها مع ما يصل إلى 5 ميكرولتر من ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل غير المنقى. قد تؤدي إضافة أكثر من 5 ميكرولتر إلى تداخلها مع عملية الهضم. نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل للحصول على ناتج أعلى أو تركيز ناتج التفاعل عن طريق التنقية العمودية باستخدام مجموعة NEB Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (5 ميكروغرام) (NEB #T1030). س: يوجد راسب في قاع أنبوب المزيج الرئيسي؟ هل هذا طبيعي؟ ج: قد يترسب مسحوق Q5® Master Mix عند تجميده وإذابته. هذا لا يدل على وجود مشكلة في المنتج. للحصول على أفضل النتائج، قم بإذابة المسحوق تمامًا، ثم أعد تعليق أي ترسبات عن طريق تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة وقلبه برفق حتى يذوب تمامًا.